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suero a tubos estériles y conservar a temperatura
inferior a –20°C, Al menos una producción de 40%
de suero es obtenido por este procedimiento.
Determinación del título de anticuerpos -
Los
ensayos de ELISA e IUTo son algunos ejemplos de
métodos inmunoquímicos que han sido encontrados
adecuados para la determinación del título de
anticuerpos.
Determinación del título de anticuerpos en
suero de cobayos por ensayo de ELISA -
Se
realizan diluciones de la muestra y del suero de
referencia en placas de ELISA adsorbidos con
toxoide tetánico. Se incluyen en cada placa un
control de suero de cobayo positivo y un control de
suero de cobayo negativo para monitorear la
performance del ensayo. Se agrega anticuerpos de
conejo o cabra anti-IgG de cobayo conjugado a
peroxidasa seguido por el agregado de un sustrato
de peroxidasa. Se mide la absorbancia y se calcula
el título relativo de anticuerpos utilizando métodos
estadísticos usuales.
Reactivos y equipamiento:
-
placas de ELISA de 96 pocillos, 1-12
columnas, filas A-H
- antisuero de cobayo contra Clostridium tetani
- conjugado de peroxidasa: anticuerpos de
conejo o cabra contra IgG de cobayo conjugados a
peroxidasa.
- toxoide tetánico
- Solución reguladora de carbonato para
cobertura pH 9,6: Disolver 1,59 g de carbonato de
sodio anhidro y 2,93 g de carbonato ácido de sodio
en 1.000 ml de agua. Distribuir en botellas de
150 ml y esterilizar por autoclave a 121 °C por
15 minutos.
- Solución reguladora salina fosfatada pH 7.4
(PBS): Disolver con agitación 80 g de cloruro de
sodio, 2,0 g de fosfato diácido de potasio, 14,3 g de
fosfato monoácido disódico dihidratado y 2,0 g de
cloruro de potasio en 1.000 ml de agua. Conservar
a temperatura ambiente para prevenir la
cristalización. Diluir 10 veces su volumen con agua
antes de usar.
- Solución de ácido cítrico: Disolver 10,51 g de
ácido cítrico en 1.000 ml de agua y ajustar la
solución a pH 4.0 con una solución de hidróxido de
sodio 400 g por litro
- Solución reguladora de lavado: PBS
conteniendo 0,5 g por litro de polisorbato 20
- Solución diluyente bloqueante: PBS
conteniendo 0,5 g por litro de polisorbato 20 y 25 g
por litro de leche descremada deshidratada.
- Sustrato de la peroxidasa: Poco antes de su
uso, disolver 10 mg de 2,2 azino-bis(3etil-
benzotiazolina-6-sulfonato)de diamonio en 20 ml
de solución de ácido cítrico. Inmediatamente antes
de su uso agregar 5 µl de solución de peróxido de
hidrogeno fuerte.
Método:
La siguiente descripción es dada como ejemplo
de un posible diseño de la placa pero pueden ser
utilizados otros diseños. Los pocillos 1 A-H son
para el suero control negativo y los pocillos 2 A-H
y 3 A-H son para el suero control positivo para
monitoreo del ensayo. Los pocillos 4-12 A-H son
para muestras. Cubrir cada pocillo de las placas de
ELISA con 100 µl de solución de toxoide tetánico
(0,5 Lf por ml en solución reguladora de carbonato
para cobertura).
Incubar toda la noche a 4 °C en una atmósfera
húmeda. Para evitar interferencia por el gradiente
de temperatura no apilar más de 4 placas. Al día
siguiente, lavar las placas completamente con
solución reguladora de lavado. Bloquear las placas
por agregado de 100 µl de solución diluyente
bloqueante en cada pocillo.
Incubar en atmósfera húmeda a 37 °C por una
hora. Lavar las placas completamente con solución
reguladora de lavado. Colocar 100 µl solución
diluyente bloqueante en cada pocillo de las placas,
excepto aquellas de la fila A. Preparar diluciones
adecuadas de suero control negativo, suero control
positivo (a partir de 0,01 UI por ml) y del suero a
ensayar. Asignar el suero control negativo a la
columna 1, suero control positivo a las columnas 2
y 3, el suero a ensayar a las columnas 4-12 y
agregar 100 µl de cada suero a los primeros 2
pocillos de la columna a la cual fue asignado.
Utilizando una micropipeta multicanal, realizar
diluciones seriadas al medio a partir de la fila B
hacia abajo de la placa hasta la fila H por
transferencia de 100 µl hacia el siguiente pocillo.
Descartar 100 µl de la última fila de manera que
todos los pocillos contengan 100 µl. Incubar a
37 °C por 2 horas. Lavar minuciosamente con
solución reguladora de lavado. Preparar diluciones
adecuadas (p.ej. una dilución 1/2000) del conjugado
de peroxidasa en solución diluyente bloqueante y
agregar 100 µl a cada pocillo. Incubar a 37 °C en
atmósfera húmeda por 1 hora. Lavar las placas con
solución reguladora de lavado. Agregar 100 µl de
sustrato de peroxidasa a cada pocillo. Incubar a
temperatura ambiente, protegido de la luz, por
30 minutos. Leer las placas a 405 nm en el mismo
orden en que el sustrato fue agregado.
Determinación del título de anticuerpos en suero
de cobayos por inhibición de la unión del toxoide o
de la toxina (IUTo).
Se agrega la toxina o el toxoide tetánico a
diluciones seriadas del suero muestra y de
referencia; la mezcla suero/ antígeno se incuban
toda la noche. Para determinar el toxoide o la toxina