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difiriendo por 2, 5 a 5 veces). Utilizar no menos de
tres diluciones en un rango de por ejemplo 0,5 a
16 UI por ml para cada una de las series. Utilizar las
diluciones para inmunización preferiblemente antes
de una hora de su preparación. Asignar una dilución
a cada grupo de cobayos.
Inmunización
-
Inyectar subcutáneamente en la
nuca de cada cobayo 1,0 ml de la dilución asignada
a cada grupo.
Extracción de sangre -
Luego de 35 a 42 días
de la inmunización, extraer una muestra de sangre a
cada cobayo vacunado y control utilizando un
método apropiado.
Preparación de muestras de suero
-
Evitar el
congelamiento y descongelamiento frecuente de las
muestras de suero. Para evitar contaminación
bacteriana es preferible realizar las manipulaciones
en un gabinete de flujo laminar.
Determinación del título de anticuerpos
-
Determinar el título de anticuerpos relativo o score
de cada muestra de suero por un método
inmunoquímico adecuado. Métodos tales como
ELISA e Inhibición de la unión de toxina (IUTo) se
consideran adecuados y son descriptos más
adelante.
Cálculo de la potencia -
Calcular la potencia de
la vacuna a ser examinada en Unidades
Internacionales relacionada a la preparación de
referencia, utilizando lo métodos estadísticos
usuales.
[
NOTA: Unidades Internacionales de
potencia refiere a la vacuna de referencia y no a las
Unidades Internacionales de la antitoxina del suero
de cobayo de referencia.
]
El ensayo sólo es válido si los límites de
confianza (
p=
0.95) son no menor que 50 por ciento
y no mayor que 200 por ciento de la potencia
estimada,; el análisis estadístico muestra pendiente
significativa y no muestra desviación de la
linealidad y del paralelismo de la curva dosis-
respuesta. El ensayo puede ser repetido pero
cuando se realiza más de un ensayo los resultados
de todos los ensayos válidos deben combinarse para
la estimación de la potencia.
El límite de confianza inferior (
P
= 0,95) de la
potencia estimada no debe ser menor de 40 U.I por
dosis humana.
CONSIDERACIONES
Método A. Ensayo de desafío en cobayos
Lectura e interpretación de los resultados
-
Con el fin de minimizar el sufrimiento de los
animales de prueba se recomienda registrar el grado
de parálisis en una escala. La escala da signos
típicos cuando la inyección de la toxina de desafío
se realiza en la región media-ventral, directamente
detrás del esternón con una aguja apropiada a través
del cuello del cobayo. El grado T3 es dado como
punto final, pero con experiencia el grado T2 puede
ser utilizado en su lugar. La toxina tetánica produce
por lo menos parálisis de 1 de los miembros
delanteros que puede ser reconocido en un estadío
temprano. El grado de tetania en cobayos se
caracteriza por los siguientes signos:
-T1: leve rigidez de un miembro delantero, pero
difícil de observar;
-T2: paresia de un miembro delantero que puede
todavía funcionar.
-T3: parálisis de 1 miembro delantero. El animal
se mueve de mala gana, el cuerpo está ligeramente
con forma de banana debido a la escoliosis.
-T4: el miembro delantero está completamente
rígido y los dedos inmóviles. La contracción
muscular de los miembros delanteros es muy
pronunciada y usualmente se observa escoliosis.
-T5: ataque tetánico, espasmo tónico continuo
de los músculos,
-D: muerte
Método B. Ensayo de desafío en ratones.
Lectura e interpretación de los resultados -
Con el fin de minimizar el sufrimiento de los
animales de prueba se recomienda registrar el grado
de parálisis en una escala como se muestra más
adelante. La escala da signos típicos cuando la
inyección de la toxina de desafío se realiza en la
región dorsal, cerca de una de las patas traseras. El
grado T3 es dado como punto final, pero con
experiencia el grado T2 puede ser utilizado en su
lugar. La toxina tetánica produce en la pata trasera
inyectada con la toxina paresia seguida de parálisis
que puede ser reconocido en un estadio temprano.
El grado de tetania en ratones se caracteriza por los
siguientes signos:
-T1: leve rigidez de la pata trasera inyectada con
la toxina, solo cuando el ratón es levantado por la
cola;
-T2: paresia de la pata trasera inyectada con
toxina, la cual puede funcionar para caminar;
-T3: parálisis de la pata posterior inyectada con
toxina; la cual no funciona para caminar;
-T4: la pata posterior inyectada con toxina está
completamente rígida con los dedos inmóviles;
-T5: ataque tetánico, espasmo tónico continuo
de los músculos,
-D: muerte
Método C. Determinación de anticuerpos en
cobayos.
Preparación de muestras de suero -
Invertir los
tubos conteniendo muestras de sangre 6 veces e
incubar en posición vertical a 37 °C por 2 horas,
luego a 4°C por 2 horas. Centrifugar a temperatura
ambiente a 800 g por 20 minutos. Transferir el