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no unida, las mezclas son transferidas a una placa
de ELISA cubierta con antitoxina tetánica. Se
agrega IgG antitetánica equina conjugada a
peroxidasa seguida por el sustrato de peroxidasa. Se
mide la absorbancia y el título de anticuerpos se
calcula utilizando métodos estadísticos usuales. Un
suero control positivo y un suero control negativo
son incluidos en cada placa para monitorear la
performance del ensayo.
Reactivos y equipamiento
:
- placas de microtitulación de poliestireno
rígidas de fondo redondeado.
- placas de ELISA de fondo plano
- toxina tetánica o toxoide tetánico
- antisuero de cobayo anti
Clostridium
tetani
- IgG equina antitetánica
- IgG equina antitetánica conjugada con
peroxidasa
- Solución reguladora carbonato pH 9,6:
Disolver 1,5 g de carbonato de sodio anhidro,
2,39 g de carbonato ácido de sodio y 0,2 g de
azida sódica en 1.000ml de agua, ajustar a pH
9,6 y autoclavar a 121 °C por 20 minutos.
- Solución reguladora acetato de sodio pH
5,5: Disolver 90,2 g de acetato de sodio
anhidro en 900 ml de agua. Ajustar a pH 5,5
usando una solución saturada de ácido cítrico
monohidratado y diluir a 1.000 ml con agua.
- Solución reguladora salina fosfatada pH
7,2 (PBS). Disolver 135 g de cloruro de sodio,
20,55 g de fosfato monoácido disódico
dihidratado y 4,8 g de fosfato diácido
monosódico monohidratado en agua y diluir a
15 litros con el mismo solvente. Autoclavar a
100 °C durante 1 hora.
- Solución reguladora diluyente: PBS
conteniendo albúmina bovina 5 g por litro y
0,5 g por litro de polisorbato 80.
- Solución reguladora bloqueante: PBS
conteniendo albúmina bovina 5 g por litro.
- Solución de tetrametilbencidina: Solución
de tetrametilbencidina 6 g por litro en alcohol.
La sustancia se disuelve dentro de los 30-40
minutos a temperatura ambiente.
- Sustrato de peroxidasa. Mezclar 90 ml de
agua, 10 ml de solución reguladora de acetato
de sodio pH 5,5; 1,67 ml de solución de
tetrametilbencidina y 20 µl de solución de
peroxido de hidrogeno fuerte.
- Solución de lavado: agua de red
conteniendo 0,5 g por litro de polisorbato 80.
Método:
Bloquear las placas de microtitulación de fondo
redondeado colocando en cada pocillo 150 µl de
solución reguladora bloqueante. Cubrir las placas
con un film o sellador. Incubar en atmósfera
húmeda a 37 °C durante 1 hora. Lavar las placas
completamente con solución de lavado. Colocar
100 µl de PBS en cada pocillo. Colocar 100 µl de la
antitoxina tetánica de cobayo de referencia en el
primer pocillo de cada una de las filas asignadas.
Colocar 100 µl del suero muestra no diluida en el
primer pocillo de cada una de las filas asignadas
utilizando una pipeta multicanal realizar diluciones
seriadas al medio a lo largo de la placa (hasta la
columna 10) por transferencia de 100 µl de
contenido al siguiente pocillo. Descartar 100 µl de
la última columna de manera que todos los pocillos
contengan 100 µl. Preparar una solución de toxina o
toxoide tetánico 0,1 Lf por ml empleando PBS
como diluyente. Agregar 40 µl de esta solución a
todos los pocillos excepto a los de la columna 12.
Los pocillos de la fila 11 son control positivo.
Agregar 40 µl de PBS a los pocillos de la columna
12 (control negativo). Agitar las placas suavemente
y cubrirlas con tapas.
Cobertura de las placas de ELISA
:
Inmediatamente antes del uso realizar una
dilución adecuada de IgG antitetánica equina en
solución reguladora carbonato pH 9,6 y agregar
100 µl a todos los pocillos. Incubar las dos series
de placas toda la noche en una atmósfera húmeda a
37°C. Cubrir las placas con las tapas. Para evitar los
efectos del gradiente de temperatura no apilar más
de cuatro placas. Al día siguiente lavar las placas de
ELISA con solución de lavado. Bloquear las placas
colocando en cada pocillo 125 µl de solución
reguladora bloqueante. Incubar a 37° C en
atmósfera húmeda por 1 hora. Lavar las placas
completamente con solución de lavado. Transferir
100 µl de la mezcla de preincubación de las placas
de poliestireno a los pocillos correspondientes de
las placas de ELISA, comenzando con la columna
12 y luego de la 1 a la 11. Cubrir las placas con
tapas. Incubar a 37°C en atmósfera húmeda por 2
hs. Lavar las placas de ELISA con solución de
lavado. Realizar una dilución adecuada (una
dilución 1 en 4.000 puede ser adecuada) de la IgG
anti tetánica equina conjugada con peroxidasa en
solución reguladora diluyente. Agregar 100 µl de
esta solución en cada pocillo y tapar las placas.
Incubar a 37 °C en atmósfera húmeda por 1,5 horas.
Lavar la placa de ELISA completamente con
solución de lavado. Agregar 100 µl de sustrato de
peroxidasa a cada pocillo. Se desarrolla un color
azul. Incubar las placas a temperatura ambiente.
Detener la reacción a un tiempo dado (dentro de los
10 minutos) por el agregado de 100 µl de ácido
sulfúrico 2 M a cada pocillo en el mismo orden de
la adición de sustrato. El color cambia de azul a
amarillo. Medir la absorbancia a 450 nm