Versión de HTML Básico
mismo stock, de alrededor de 5 semanas de edad, de
una cepa que haya mostrado ser adecuada.
Distribuir los ratones en no menos de 6 grupos
iguales, utilizar grupos conteniendo un número de
animales suficiente para obtener resultados que
cumplan los requerimientos de validez del ensayo.
Si la toxina de desafío a ser utilizada no ha
mostrado ser estable o no ha sido adecuadamente
estandarizada, incluir 3 grupos de no menos de 5
ratones como controles no vacunados. Utilizar
ratones del mismo sexo o machos y hembras
igualmente distribuidos entre los grupos.
Selección de la toxina de desafío -
Seleccionar
una preparación de toxina tetánica conteniendo no
menos de 100 veces la dosis paralítica 50 % por
mililitro. Si la preparación de la toxina de desafío
ha demostrado ser estable, no es necesario verificar
la dosis paralítica para cada ensayo.
Preparación de la solución de la toxina de
desafío -
Diluir inmediatamente antes de emplear,
la toxina con un diluyente adecuado (por ejemplo,
solución salina peptonada regulada pH 7.4) para
obtener una solución de toxina de desafío estable
conteniendo aproximadamente 50 veces la dosis
paralítica 50 % en 0.5 ml. Cuando sea necesario,
diluir porciones de la solución de la toxina de
desafío 1/16, 1/50 y 1/160 con el mismo diluyente
para determinar la actividad de la toxina.
Dilución de la muestra y de la preparación de
referencia -
Preparar diluciones de la vacuna a ser
examinada y de la preparación de referencia usando
una solución de 9 g de cloruro de sodio por litro, de
forma tal que, las diluciones formen una serie
difiriendo por no más de 2, 5 veces y que las
diluciones intermedias, cuando son inyectadas
subcutáneamente a una dosis de 0,5 ml por ratón
proteja aproximadamente el 50 por ciento de los
animales de los efectos paralíticos de la inyección
subcutánea de la cantidad de toxina tetánica
indicada para ese ensayo.
Inmunización y desafío -
Asignar una dilución a
cada grupo de ratones e inyectar subcutáneamente
0,5 ml de cada dilución en cada ratón del grupo al
cual la dilución fue asignada. Después de 28 días,
inyectar subcutáneamente en cada animal 0,5 ml de
la solución de toxina de desafío (conteniendo 50
veces la dosis paralítica 50 %).
Determinación de la actividad de la toxina de
desafío -
Si es necesario, asignar tres diluciones
realizadas a partir de la solución de toxina de
desafío, a cada uno de los tres grupos de no menos
de 5 ratones e inyectar subcutáneamente 0,5 ml en
cada ratón en el grupo en la cual esa dilución fue
asignada.
Lectura e interpretación de los resultados -
Examinar los ratones 2 veces al día. Remover y
sacrificar todos los animales que muestren signos
definidos de parálisis tetánica. Contar el número de
ratones sin parálisis cuatro días después de la
inyección de la toxina de desafío. Calcular la
potencia de la vacuna a ser examinada relacionada a
la potencia de la preparación de referencia en base a
la proporción de animales desafiados sin parálisis
en cada uno de los grupos de los ratones vacunados,
utilizando los métodos estadísticos usuales.
El ensayo sólo es válido si para la vacuna a ser
examinada y la preparación de referencia, la dosis
protectiva 50 % cae entre la mayor y la menor dosis
de las preparaciones dadas a los ratones; cuando
corresponda, el número de animales paralizados en
los tres grupos de no menos de 5 animales
inyectados con las diluciones de la solución de la
toxina de desafío indican que el desafío fue
aproximadamente 50 veces la dosis paralítica 50 %;
los límites de confianza (
p=
0.95) son no menor que
el 50 por ciento y no mayor que el 200 por ciento
de la potencia estimada; el análisis estadístico
muestra pendiente significativa y no muestra
desviación de la linealidad y del paralelismo de las
curvas dosis-respuesta. El ensayo puede ser
repetido pero cuando se realiza más de un ensayo,
los resultados de todos los ensayos válidos deben
ser combinados para la estimación de la potencia.
Método C. Determinación de anticuerpos en
cobayos
.
Selección y distribución de los animales para el
ensayo -
Emplear en el ensayo, cobayos sanos
provenientes del mismo stock, de 250-350 gr. de
peso. Utilizar cobayos del mismo sexo o machos y
hembras igualmente distribuidos entre los grupos.
Distribuir los cobayos en no menos de 6 grupos
iguales, utilizar grupos conteniendo un número de
animales suficiente para obtener resultados que
cumplan los requerimientos de validez del ensayo.
Emplear un grupo de cobayos no vacunados del
mismo origen como control de suero negativo. Si la
consistencia del ensayo fue demostrada se puede
utilizar un control de suero negativo de referencia.
Preparación de referencia -
Emplear una
preparación de referencia adecuada o un lote de
vacuna que haya demostrado ser efectiva en
estudios clínicos, o un lote representativo de éste
que hayan sido calibradas en Unidades
Internacionales con una vacuna adsorbida contra
tétanos de referencia o con un estándar
Internacional para el toxoide tetánico adsorbido.
Dilución de la muestra y de la preparación de
referencia -
Preparar diluciones seriadas de la
vacuna a ser examinada y de la preparación de
referencia empleando una solución de cloruro de
sodio 9 g por litro (pueden ser adecuadas series