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inoculación con el lote semilla de trabajo del virus,
se debe separar un mínimo de 5 % o 1.000 ml, la
cantidad que sea menor, de los cultivos celulares
empleados en la producción de la vacuna, como
muestra de cultivos celulares no infectado (control
celular). Cuando la vacuna se produce en cultivos
primarios de células renales de mono, se aplican a
las
células
control
requisitos
especiales
especificados a continuación. La suspensión viral se
cosecha como máximo 4 días después de la
inoculación del virus. Luego de la inoculación del
cultivo celular de producción con el lote semilla de
trabajo del virus, los cultivos celulares infectados se
mantienen a una temperatura constante entre 33 y
35 °C; con una precisión de ± 0,5 °C. Los cultivos
celulares control se deben mantener entre 33 y 35 °
C durante los períodos de incubación pertinentes.
Para la preparación de las mezclas de cosechas
monovalentes, sólo se pueden emplear cosechas de
virus individuales que cumplan los siguientes
requisitos:
Concentración de virus
Controlar la concentración de la cosecha de
virus según se indica en
Valoración
para asegurar la
uniformidad de la producción y para determinar la
dilución a utilizar en la vacuna final a granel.
Ensayo para agentes extraños en vacunas
virales <415>
Debe cumplir con los requisitos.
Células control
Las células control del cultivo celular de
producción a partir del cual se obtiene la cosecha
viral deben cumplir con el ensayo de
Identificación
y con los requisitos de
415. Ensayo para
a
gentes
extraños en vacunas virales
. Si se emplean cultivos
de células primarias de mono deben cumplir con los
siguientes requisitos.
Cultivo de células primarias de mono
Se deben aplicar los siguientes requerimientos
especiales a la multiplicación y cosecha viral en
cultivos de células primarias de riñón de mono.
Cultivos celulares
El día de inoculación con el virus del lote
semilla de trabajo, se debe examinar cada cultivo
celular con el fin de comprobar que no presenta
degeneraciones causadas por un agente infeccioso.
Si se detecta la presencia de algún agente extraño
en un cultivo celular, se rechaza la totalidad del
grupo de cultivos relacionados con el mismo.
El día de la inoculación con el virus del lote
semilla de trabajo, una muestra de al menos 30 ml
de la mezcla de líquidos procedentes de cultivos
celulares de los riñones de cada mono, o de fetos de
un máximo de 10 monos pretérmino se divide en
dos alícuotas iguales. Una de éstas se ensaya en
cultivos de células renales de mono procedentes de
la misma especie que el animal utilizado para la
producción de la vacuna, pero no del mismo animal.
La otra alícuota se ensaya, si fuera necesario, en
cultivos de células renales de mono de otra especie,
de modo que los ensayos se realicen sobre cultivos
celulares procedentes de al menos una especie que
sea de sensibilidad conocida frente al virus SV40.
La mezcla de líquidos se debe inocular en los
frascos que contienen estos cultivos celulares de
modo que la dilución de la mezcla en el medio
nutritivo no exceda la proporción 1 en 4. El área de
la capa celular debe ser al menos de 3 cm
2
por ml
de mezcla de fluidos. Al menos un frasco de cada
tipo de cultivo celular no se debe inocular para
emplear como control. Si la especie de mono
utilizada para la producción de la vacuna es sensible
a SV40 no es necesario repetir la prueba en una
segunda especie. Se puede utilizar suero animal en
la propagación de las células, con la condición de
que no contenga anticuerpos SV40. Luego de la
inoculación de la preparación en ensayo, el medio
de mantenimiento no debe contener suero añadido
salvo en las condiciones anteriormente descriptas.
Los cultivos se deben incubar a una temperatura
entre 35 y 37 °C y se deben observar durante un
período no menor de 4 semanas. Durante este
período de observación, no antes de las 2 semanas
de incubación, se efectúa como mínimo un
subcultivo del fluido de cada uno de los cultivos en
el mismo sistema de cultivo celular. Los subcultivos
también se deben mantener en observación durante
al menos 2 semanas. Se puede agregar suero al
cultivo original en el momento del subcultivo, con
la condición de que no contenga anticuerpos SV40.
Las técnicas de inmunofluorescencia pueden
resultar útiles para la detección del virus SV40 o de
otros virus en las células. Se debe verificar la
ausencia del herpesvirus B (
Cercopithecine
herpesvirus I
) y de otros virus en cultivos celulares
de riñón de conejo en otra muestra de al menos
10 ml de mezcla líquida.
Se debe demostrar que el suero empleado en el
medio nutritivo de los cultivos está libre de
inhibidores del virus B. El herpesvirus humano se
debe emplear como indicador de la ausencia de los
inhibidores del virus B, debido al peligro que
implica la manipulación del herpesvirusB
(
Cercopithecine herpesvirus I
). La muestra se debe
inocular en los frascos que contienen los cultivos
celulares, de modo que la dilución de la mezcla en
el medio nutritivo no sea mayor de la proporción 1
en 4. El área de la capa celular debe ser al menos
3 cm
2
/ ml de mezcla líquida. Al menos un frasco
de cada tipo de cultivo celular no se debe inocular
para ser empleada como control.