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760 nm usando un blanco preparado empleando
0,4 ml de hidróxido de sodio 0,1 M. Dibujar una
curva de calibración a partir de las absorbancia
medidas de las 6 soluciones de referencia en
función del correspondiente contenido de proteína
de dichas soluciones y leer a partir de la curva el
contenido de proteína presente en la muestra.
Ácido nucleico
No más de 1,0 %, calculado con respecto a la
sustancia seca. Proceder del siguiente modo:
Solución muestra
- Preparar una solución que
contenga 5 mg por ml de polisacárido seco.
Transferir cuantitativamente el contenido de un
envase de la vacuna al matraz y diluir a volumen
con agua. Diluir la solución muestra si es necesario
para obtener un valor de absorbancia adecuado.
Medir la absorbancia a 260 nm usando agua como
blanco. La absorbancia de una solución de 1 g de
ácido nucleico por litro a 260 nm es 20.
Ensayos de endotoxinas bacterianas
<330>
No más de 25 U.I. de endotoxina por
µ
g de
PRP.
Residuos de reactivos
Cuando se requiera, se efectúan ensayos para
determinar residuos de los reactivos utilizados
durante la inactivación y purificación. Se establece
un valor aceptable para cada reactivo de un
producto particular y cada lote de PRP debe
cumplir con dichos límites. Si los estudios de
validación han demostrado la remoción de un
reactivo residual, se puede omitir el ensayo en el
PRP.
Proteína transportadora
La proteína transportadora se elige de modo
que, una vez conjugada al PRP, sea capaz de
inducir una respuesta inmunitaria T dependiente.
Las proteínas transportadoras y los métodos de
acoplamiento actualmente aprobados se indican, a
título de información, en la
Tabla 2
. Las proteínas
transportadoras se obtienen por cultivo de
microorganismos adecuados. Se debe verifica la
pureza bacteriológica del cultivo; éste se puede
inactivar; la proteína transportadora debe ser
purificada mediante un método apropiado.
Tabla 2 .
Requerimientos del conjugado a granel para los productos actualmente aprobados.
Ensayo
Vector proteico
Toxoide diftérico Toxoide tetánico
CRM 197
OMP
PRP libre
< 37%
< 20 %
< 25%
< 15%
Proteína libre
< 4 %
< 1 %; cuando
proceda
< 1% o < 2% según el
método de acoplamiento no aplicable
Relación PRP: proteína
1,25 – 1,8
0,30-0,55
0,3 – 0,7
0,05 – 0,1
agarosa reticulada
para cromatografía R
95 % < 0,75
60% < 0,2
50% 0,3 – 0,6
85% < 0,3
agarosa reticulada
para cromatografía R1
0,6 – 0,7
85% < 0,5
En la preparación del conjugado sólo se puede
utilizar una proteína transportadora que cumpla con
los siguientes requisitos.
Identificación
Identificar la proteína transportadora mediante
un método inmunoquímico apropiado (ver
635.
Métodos inmunoquímicos
)
Ensayos de esterilidad
<370>
Realizar el ensayo utilizando para cada medio
10 ml o el equivalente a 100 dosis, eligiendo la
cantidad que sea menor.
Toxoide diftérico
Proceder según se indica en
Toxoide diftérico
purificado a granel
en
Vacuna contra la Difteria,
Adsorbida
.
Toxoide tetánico
Proceder según se indica en
Toxoide tetánico
purificado a granel
en
Vacuna contra el Tétanos,
Adsorbida
. La pureza antigénica no debe ser menor
de 1.500 Lf por mg de nitrógeno proteico.
Proteína diftérica CRM 197
Debe contener no menos de 90 % de proteína
diftérica CRM 197, determinada mediante un
método adecuado. Realizar ensayos adecuados,
para la validación o rutina, para demostrar que el
producto no es tóxico.
OMP (Complejo proteico de la membrana
externa de Neisseria meningoccica grupo B)
Debe contener no más de 8 % de
lipopolisacárido, determinado por un método
apropiado. Debe cumplir con los requisitos de
340.
Ensayo de piretógenos
, inyectando a cada conejo
0,25
µ
g de OMP por kg de masa corporal.