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Ribosa
No menos de 32 %, calculado en base a la
sustancia seca. Proceder del siguiente modo:
Solución estándar
- Disolver 25 mg de ribosa
en agua y diluir a 100 ml con el mismo solvente
Inmediatamente antes de su uso, diluir 1 ml de esta
solución a 10 ml con agua. Transferir 0,10 ml;
0,20 ml; 0,40 ml; 0,60 ml; 0,80 ml y 1,0 ml de la
solución obtenida a sendos tubos.
Solución muestra
- Preparar una solución en un
matraz apropiado que contenga 5 mg de
polisacárido
seco
por
ml.
Transferir
cuantitativamente el contenido de un envase de la
vacuna a esta solución y diluir a volumen con agua.
Diluir la solución tal que el volumen usado en el
ensayo contenga 2,5 µg a 25 µg de ribosa.
Transferir 0,20 ml y 0,40 ml de la solución obtenida
a sendos tubos por triplicado.
Procedimiento
- Completar el volumen de cada
tubo hasta obtener 2 ml con agua y mezclar.
Agregar 2 ml de una solución de 0,5 g de cloruro
férrico por litro en ácido clorhídrico a cada tubo y
mezclar. Agregar 0,2 ml de una solución de orcinol
en alcohol. Colocar los tubos en un baño de agua
durante 20 minutos. Colocar en agua congelada.
Medir la absorbancia de cada solución a 670 nm
usando un blanco preparado con 2 ml agua.
Realizar una curva de calibración a partir de las
absorbancia medidas para las
Soluciones estándar
en función del correspondiente contenido de ribosa
en las mismas y leer a partir de la curva la cantidad
de ribosa presente en la muestra de cada volumen
ensayado. Calcular el promedio de los tres valores.
Fósforo
Entre 6,8 % y 9,0 %, calculado en base a la
sustancia seca. Proceder del siguiente modo.
Solución estándar
- Disolver 0,2194 g de
fosfato dihidrógeno de potasio en 500 ml en agua
hasta obtener una solución conteniendo un
equivalente de 0,1 mg de fósforo por ml. Diluir
5,0 ml de la solución a 100 ml con agua. Transferir
0,5 ml; 1,0 ml y 2,0 ml de la solución diluida a 3
tubos de ignición.
Solución muestra
- Preparar una solución que
contenga 5 mg por ml de polisacárido seco.
Transferir cuantitativamente el contenido de un
envase de la vacuna al matraz y diluir a volumen
con agua. Diluir la solución tal que el volumen
usado
en
el
ensayo
(1 ml)
contenga
aproximadamente 6 µg de fósforo. Transferir 1 ml
de esta solución a un tubo de ignición de 10 ml.
Procedimiento
- Agregar a todos los tubos
0,2 ml de ácido sulfúrico y calentar en un baño de
aceite a 120 °C durante 1 hora y luego a 160 °C
hasta
la
aparición
de
humos
blancos
(aproximadamente 1 hora). Enfriar y agregar
0,1 ml de una ácido perclórico y calentar a 160 °C
hasta que la solución se decolore (aproximadamente
90 minutos). Enfriar y agregar a cada tubo 4 ml de
agua y 4 ml de reactivo de molibdato de amonio.
Calentar en baño de agua a 37 °C durante
90 minutos y enfriar. Ajustar el volumen a 10 ml
con agua. El color azul desarrollado es estable por
algunas horas. Medir la absorbancia de cada
solución a 820 nm usando un blanco para
compensación de líquido. Realizar una curva de
calibración a partir de las absorbancia medidas para
las tres
Soluciones estandar
en función de la
cantidad de fósforo en dichas soluciones y leer a
partir de la curva la cantidad de fósforo presente en
la muestra.
Proteínas
No más de 1,0 %, calculado con respecto a la
sustancia en base seca. Emplear una cantidad
suficiente de PRP que permita la detección de
proteínas de una concentración de 1 % o mayor.
Proceder del siguiente modo:
Solución estándar
- Disolver 0,100 g de
albúmina bovina en 100 ml de una solución 0,1 M
de hidrogeno de sodio. Diluir 1,0 ml de esta
solución en 20 ml de hidrogeno de sodio 0,1 M
(solución madre). Diluir 1 ml de esta solución en
4 ml de hidrogeno de sodio 0,1 M (solución
diluida). Transferir a seis tubos de vidrio 0,10 ml;
0,20 ml, y 0,40 ml de la solución madre y 0,15 ml,
0,20 ml y 0,25 ml de solución diluida. Completar el
volumen de cada tubo hasta 0,40 ml utilizando
hidrogeno de sodio 0,1 M.
Solución muestra
- Preparar una solución que
contenga 5 mg por ml de polisacárido seco.
Transferir cuantitativamente el contenido de un
envase de la vacuna al matraz y diluir a volumen
con agua. Transferir 1 ml de la solución a un tubo
de vidrio y agregar 0,15 ml de una solución de
400 g por litro de ácido tricloroacético. Mezclar,
dejar en reposo por 15 minutos, centrifugar durante
10 minutos a 5.000 rpm y descartar el sobrenadante.
Agregar al precipitado de centrifugación 0,4 ml de
hidrogeno de sodio 0,1 M.
Procedimiento -
Agregar a todos los tubo 2 ml
de solución de tartárico-cúprico, mezclar y dejar en
reposo durante 10 minutos. Agregar a cada tubo
0,2 ml de una mezcla de volúmenes iguales de
reactivo de fosfomolibdeno-tungstico y agua,
preparada inmediatamente antes de su uso. Tapar
los tubos y agitar por inversión y mantener en la
oscuridad durante 30 minutos. El color azul
desarrollado debe ser estable por 60 minutos. Si es
necesario centrifugar para obtener una solución más
clara. Medir la absorbancia de cada solución a