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dar A
o la
Solución estándar B
, según corresponda, y
la
Solución muestra
, registrar los cromatogramas
aproximadamente durante 50 minutos y medir las
respuestas de los picos. En el cromatograma obtenido
con cualquiera de las
Soluciones estándar
, la desami-
do insulina A-21 aparece como un pequeño pico des-
pués del pico principal y tiene un tiempo de retención
de aproximadamente 1,3 respecto al pico principal.
En el cromatograma obtenido a partir de la
Solución
muestra
, la respuesta del pico correspondiente a de-
samido insulina A-21 no debe ser mayor que 3,0 % de
la respuesta total de los picos. A excepción de los
picos correspondiente a la insulina y a la desamido
insulina A-21, la suma de las respuestas de todos los
picos no debe ser mayor de 3,0 % de la respuesta total
de los picos.
Inmunorreactividad similar a la de proinsulina
(IPI)
No más de 10 ppm, calculado sobre la sustancia
seca y determinado por un método inmunoquímico
sensible y apropiado como por ejemplo, radioinmuno-
análisis (ver
635. Métodos inmunoquímicos
), emple-
ando el Reactivo de Referencia Internacional para
proinsulina porcina o proinsulina bovina, según co-
rresponda, para calibrar el método.
Impurezas con peso molecular mayor que la in-
sulina
Sistema cromatográfico
- Examinar la Insulina
correspondiente por cromatografía de exclusión por
tamaño molecular, empleando un equipo para croma-
tografía de líquidos con un detector ultravioleta ajus-
tado a 276 nm y una columna de 30 cm
×
7,5 mm con
fase estacionaria constituida por gel de sílice hidrofí-
lico de 5 a 10 µm de diámetro en un grado apropiado
para la separación del monómero de Insulina de los
dímeros y polímeros. El caudal debe ser aproxima-
damente 0,5 ml por minuto.
Solución de arginina
- Preparar una solución de
L
-arginina en agua de aproximadamente 1 mg por ml.
Fase móvil
-
Solución de arginina
, acetonitrilo y
ácido acético glacial (65:20:15). Filtrar y desgasifi-
car. Hacer los ajustes necesarios (ver
Aptitud del
sistema
en
100. Cromatografía
).
Solución de resolución
- Emplear una solución de
Insulina de aproximadamente 4 mg por ml, que con-
tenga más de 0,4 % de proteínas de alto peso molecu-
lar.
Se puede emplear una preparación inyectable de
Insulina, tanto si es una solución como una suspen-
sión, que ha sido aclarada con una cantidad suficiente
de ácido clorhídrico 6 N, que contenga el porcentaje
indicado de proteínas de elevada masa molecular o
una solución preparada a partir de Insulina en polvo,
disuelta en ácido clorhídrico 0,01 N. Esta última se
puede preparar dejando en reposo la Insulina en polvo
a temperatura ambiente durante 10 días aproximada-
mente. [NOTA: mantener la temperatura de las solu-
ciones entre 2 y 10 ºC y emplearlas en un lapso de 7
días].
Solución muestra
- Disolver 4 mg de la Insulina
correspondiente en 1,0 ml de ácido clorhídrico
0,01 N.
[NOTA: si se emplea un inyector automático,
mantener la temperatura entre 2 y 10 ºC.]
Aptitud del sistema
(ver
100. Cromatografía
) -
Equilibrar la columna mediante al menos tres inyec-
ciones repetidas de
Solución de resolución
. La co-
lumna está equilibrada cuando se obtienen resultados
repetitivos en dos inyecciones consecutivas. Croma-
tografiar la
Solución de resolución
y registrar las
respuestas de los picos según se indica en
Procedi-
miento
: los tiempos de retención deben ser de 13 a 17
minutos para los complejos de insulina poliméricos;
aproximadamente 17,5 minutos para los dímeros de
insulina covalentes; aproximadamente 20 minutos
para los monómeros de insulina, y aproximadamente
22 minutos para las sales; la resolución
R
definida por
la relación entre la altura del pico del dímero y la
altura del valle de separación entre los picos del
monómero y del dímero debe ser mayor o igual de
2,0.
Procedimiento
- Inyectar en el cromatógrafo
100
µ
l de la
Solución muestra
, registrar el cromato-
grama aproximadamente durante 35 minutos y medir
las respuestas de los picos, ignorando cualquier pico
con un tiempo de retención mayor que el del pico de
la Insulina. La suma de las respuestas de los picos
con un tiempo de retención menor que el del pico
principal no debe ser mayor de 1,0 % de la respuesta
total de los picos.
Cinc
No debe contener más de 1 % de cinc, calculado
sobre la sustancia seca.
MÉTODO A
Solución madre del estándar
- Disolver una can-
tidad apropiada de cinc en ácido clorhídrico 0,01 N
para obtener una solución de aproximadamente 5 mg
por ml.
Soluciones estándar
- Preparar soluciones que
contengan 0,4; 0,8; 1,0; 1,2 y 1,6 µg de cinc por ml,
preparadas en el momento de su uso por dilución de la
Solución madre del estándar
.
Solución muestra
- Disolver 50,0 mg de la Insuli-
na correspondiente en ácido clorhídrico 0,01 N y
diluir a un volumen de 25,0 ml con el mismo ácido. Si
fuera necesario, diluir con ácido clorhídrico 0,01 N
hasta obtener una concentración de aproximadamente
0,4 a 1,6 µg de cinc por ml.