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proporcional a la concentración de anticuerpo en el
gel.
En los
métodos de doble difusión
se establecen
gradientes de concentración para ambos reactivos.
El antígeno y el anticuerpo difunden desde lugares
separados en un gel inicialmente neutro desde el
punto de vista inmunológico.
Los
métodos comparativos de difusión doble
se
emplean para comparar, cualitativamente, diversos
antígenos frente a un anticuerpo apropiado o vice-
versa. La comparación se basa en la presencia o
ausencia de interacción entre las líneas de precipita-
ción. Se pueden distinguir las reacciones de identi-
dad, de no identidad o de identidad parcial de antí-
genos/anticuerpos.
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La inmunoelectroforesis (IE) es una técnica cua-
litativa que combina dos métodos: la electroforesis
en gel seguida de la inmunodifusión.
La
inmunoelectroforesis cruzada
es una modifi-
cación del método de IE, apropiada para ensayos
cuali y cuantitativos. En una primera fase de la
técnica, se lleva a cabo una electroforesis en gel
clásica tras la cual la banda longitudinal del gel, que
contiene las fracciones a ensayar, se corta y se
transfiere a otra placa. Esta nueva placa se somete
a una segunda electroforesis, en un ángulo de 90°
respecto a la primera corrida electroforética, emple-
ando un gel que contiene una concentración de
anticuerpos comparativamente menor con respecto
a los antígenos correspondientes. Para una concen-
tración de anticuerpos y un espesor de gel determi-
nados, la relación entre la respuesta de cada uno de
los picos de precipitación y la cantidad del antígeno
correspondiente es lineal.
El
electroinmunoensayo
, a menudo denominado
rocket inmunoelectroforesis, es un método rápido
cuantitativo para determinar antígenos con carga
diferente de los anticuerpos o viceversa. La electro-
foresis del antígeno que va a ser analizado se lleva a
cabo en un gel que contiene una concentración
comparativamente menor del correspondiente anti-
cuerpo. La preparación muestra y las diluciones del
antígeno empleado como estándar se introducen en
diferentes orificios del gel. Durante la electrofore-
sis se forman arcos de precipitación de forma pun-
tiaguda denominada "rockets" que migran desde los
orificios. Cuando el antígeno ya no está en exceso
el frente del precipitado detiene su avance. Para una
concentración dada en anticuerpo, la relación entre
la distancia recorrida por el precipitado y la canti-
dad de antígeno aplicada es lineal.
La
contrainmunoelectroforesis
es un método
cuantitativo rápido que permite establecer gradien-
tes de concentración de antígeno externo y anti-
cuerpo externo en un campo eléctrico según sus
diferentes cargas. Las diluciones de un estándar de
calibración y las diluciones de la preparación mues-
tra se introducen en una fila de orificios en el gel y
en una fila de orificios opuesta a la primera se in-
troduce una cantidad conocida del reactivo corres-
pondiente. El título de la preparación muestra en-
sayada se puede considerar como la dilución más
elevada que da lugar a línea de precipitación.
Existen diversas modificaciones de la
inmunoe-
lectroforesis
cruzada y de los métodos de
elec-
troinmunoensayo
.
Otras técnicas combinan la separación de los
antígenos según su tamaño molecular y sus propie-
dades serológicas.
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Estas pueden realizarse mediante tinciones se-
lectivas o no selectivas, por fluorescencia, mediante
marcación enzimática e isotópica o por otras técni-
cas apropiadas. Los métodos de tinción selectiva
son los empleados, habitualmente, para la caracteri-
zación de sustancias no proteicas en los precipita-
dos.
En los geles traslúcidos, como los de agar o aga-
rosa, la línea de precipitación es visible claramente,
siempre que la concentración de cada uno de los
reactivos sea la apropiada.
VALIDACIÓN DEL MÉTODO
Criterios de validación
El método inmunoquímico cuantitativo solo es
válido si:
1) El antígeno o anticuerpo no discrimina entre
preparación muestra y estándar.
2) El método no se ve afectado por otros com-
ponentes de la preparación muestra o de sus exci-
pientes, que pueden variar de una muestra a otra.
Estos componentes pueden incluir concentraciones
elevadas de otras proteínas, sales, conservantes o
actividad proteolítica contaminante.
3) El límite de cuantificación es inferior al crite-
rio de aceptación indicado en la monografía corres-
pondiente.
4) La precisión de la valoración es tal que la va-
rianza de los resultados corresponde a la exigencia
establecida en la monografía correspondiente.