Versión de HTML Básico
método de incorporación en placa (ver más
adelante). Los valores de reversión espontánea
deben encontrarse dentro del rango de valores
histórico del laboratorio para cada cepa o del
informado por el proveedor.
ENSAYO DE SALMONELLA/FRACCIÓN
MICROSOMAL (TEST DE AMES) PARA
DETECCIÓN DE MUTAGENICIDAD
En esta sección se describirá la realización del
Ensayo de
Salmonella
/Fracción microsomal (Test
de Ames) para la detección de mutagenicidad de
compuestos químicos y productos biológicos.
PREPARACIÓN DE MUESTRAS
Solventes
Se utilizará preferentemente agua destilada
estéril. Si la muestra a probar no es soluble en agua
se utilizará dimetil sulfóxido.
Si se emplea otro solvente se realizará un
ensayo preliminar de toxicidad del mismo para
determinar la concentración máxima que no afecte
el crecimiento y supervivencia bacterianos.
Determinación preliminar de la toxicidad de
la muestra en estudio
Para esta etapa se empleará el procedimiento de
incorporación en placa del Test de Ames que se
describe más adelante.
Se realizará un ensayo preliminar de toxicidad
para determinar la dosis máxima de la muestra que
puede emplearse en el ensayo de mutagenicidad.
Esta prueba se realizará en ausencia y presencia
de la mezcla de activación metabólica y deberán
incluirse un control positivo y uno de solvente. Se
probarán al menos tres concentraciones de la
solución (acuosa u orgánica) de la muestra.
El ensayo de toxicidad puede llevarse a cabo
con una sola cepa (TA100 o TA98, o las cepas que
se emplearán en el ensayo definitivo).
La cepa se pondrá en presencia de su mutágeno
específico (por ej. 2-nitro fluoreno para TA98) y se
observará la disminución en el recuento de
revertantes como resultado de la inhibición de
crecimiento por la muestra.
Se empleará la menor dilución de la muestra que
no inhiba el crecimiento bacteriano para la
realización del ensayo definitivo.
En el caso de productos no tóxicos se propone
una dosis máxima entre 5 y 10 mg por placa
siempre que la solubilidad de los mismos lo
permita.
PROCEDIMIENTOS
Ensayo de incorporación en placa
En este ensayo se exponen directamente las
cepas de
Salmonella
a la acción de la muestra a
probar sobre
Placas de medio mínimo-glucosa
(MG)
en presencia y ausencia de
Mezcla S-9.
Procedimiento experimental
1) Preparar los cultivos de trabajo según lo
descripto anteriormente.
2) Rotular las
Placas de medio mínimo-glucosa
(MG)
y los tubos de vidrio estériles de
13 100 mm.
3) Preparar la
Mezcla S-9
y mantenerla sobre
hielo hasta el momento de su uso.
4) Preparar las diluciones de la muestra a ser
probadas.
Se propone un mínimo de cinco
diluciones de la muestra en estudio, que cubran un
rango de tres órdenes de magnitud.
5) Preparar el
Agar blando suplementado con
histidina/biotina
y mantenerlo a 43 - 45 ºC.
6) Agregar a los tubos de vidrio estériles
mantenidos a 43 - 45 ºC, en el orden siguiente y
mezclando después de cada agregado:
Entre 2 y 3 ml de
Agar blando suplementado
con histidina/biotina
.
0,50 ml de la
Mezcla S9
o de
Solución
reguladora de fosfato de sodio 0,2 M pH
7,4
según corresponda
0,05 ml de la muestra en ensayo
0,1 ml del cultivo de trabajo de la cepa de
Salmonella
(entre 1 y 2 10
8
ufc por tubo).
7) Volcar el contenido de cada tubo en una placa
de agar
MG
y dejar solidificar el agar blando a
temperatura ambiente.
8) Invertir las placas y colocarlas en la estufa de
cultivo a 35 - 37 ºC durante 48 horas.
9) Contar las colonias revertantes aparecidas en
cada placa.
Sembrar cada condición por triplicado.
Ensayo de preincubación
En esta variante del método se preincuba la
solución de la muestra con la cepa
(aproximadamente 10
8
ufc por tubo) en presencia y
ausencia del sistema de activación metabólica
durante 20 a 30 minutos a 35 - 37 ºC antes de
mezclar con el
Agar blando suplementado con
histidina/biotina
y volcarlo sobre la superficie de la
placa de medio mínimo con glucosa.
Los tubos deben ser preincubados con agitación
.
Procedimiento experimental
1) Preparar los cultivos de trabajo según lo
descripto anteriormente.
2) Rotular las placas
MG
y los tubos de vidrio
estériles de 13 100 mm.
3) Preparar la
Mezcla S9
y mantenerla sobre
hielo hasta el momento de usar.
4) Preparar las diluciones de la muestra a ser
probada.
Se propone un mínimo de cinco