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diluciones de la muestra en estudio, que cubran un
rango de tres órdenes de magnitud.
5) Agregar a los tubos de vidrio estériles
mantenidos a 43 - 45 ºC, en el orden siguiente y
mezclando después de cada agregado:
0,50 ml de la
Mezcla S9
o de
Solución
reguladora de fosfato de sodio 0,2 M pH 7,4
según corresponda.
0,05 ml de la muestra a probar
0,1 ml del cultivo de trabajo de la cepa de
Salmonella
(entre 1 y 2 10
8
ufc por tubo)
6) Incubar los tubos en baño con agitación a 35 -
37 °C durante 20-30 minutos. Concluida la
incubación agregar a cada tubo entre 2 y 3 ml de
Agar blando suplementado con histidina/biotina
previamente fundido y mantenido a 43 – 45 ºC.
7) Volcar el contenido de cada tubo en una placa
de agar
MG
y dejar solidificar el agar blando a
temperatura ambiente.
8) Invertir las placas y colocarlas en la estufa de
cultivo a 35 - 37 ºC durante 48 horas.
9) Contar las colonias revertantes aparecidas en
cada placa.
Sembrar cada condición por triplicado.
Controles positivos y negativos
En todas las pruebas deben incluirse controles
positivos y negativos.
El
control negativo
es el solvente empleado para
solubilizar y diluir la muestra en estudio y deberá
ser probado en ausencia y presencia de la
Mezcla S-9.
Los
controles positivos
se emplean en las
cantidades por placa que se indican a continuación:
Tabla 2
. Control positivo (con activación metabólica)
Cepa
Cantidad de mutágeno por placa
TA 97a, TA 98 y
TA 100
2-Amino antraceno
TA 102
de 2-Amino antraceno
En el caso del 2-Amino antraceno es necesario ensayar en ausencia y presencia de la
Mezcla S-9
ya que adquiere
actividad mutagénica al ser metabolizado.
Tabla 3
. Control positivo (sin activación metabólica)
Cepa
Cantidad de mutágeno por placa
TA 97a
de 9-Aminoacridina (clorhidrato.hidrato)
TA 98 y TA 1538
de Nitrofurantoína
TA 100 y TA 1535
de Azida sódica
TA 102
0,
de Mitomicina C
Los mutágenos que figuran en esta tabla tienen actividad mutagénica
per se
.
Se pueden emplear otros mutágenos de probada acción sobre la cepa de interés.
Registro de los resultados
Se completará una planilla por cada una de las
cepas empleadas, con y sin activación metabólica.
En las mismas deben figurar los resultados de las
lecturas de cada una de las tres placas, el promedio
y el desvío estándar en las cinco concentraciones de
muestra y en los controles.
Evaluación de los resultados
Los datos se evalúan según los siguientes
criterios:
Una muestra se considera
Positiva
(mutagénica)
si el número promedio de revertantes, con
cualquiera de las cepas y en cualquiera de las
concentraciones probadas, es al menos dos veces
mayor que el número de revertantes detectadas en el
control negativo y se observa un incremento
relacionado con la concentración en las revertantes
por placa con la misma cepa.
Una muestra se considera
Negativa
(no
mutagénica) si no hay ninguna concentración en la
que se produce un número promedio de revertantes
por placa superior por lo menos en dos veces al
número de revertantes detectadas en el control
negativo y no muestra un incremento de revertantes
relacionado con la concentración.
Deben realizarse dos ensayos independientes
con cada muestra.
Cuando se obtengan resultados positivos es
conveniente repetir el ensayo en condiciones