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hígado de rata (fracción microsomal S-9) que ha
sido previamente inducida con una mezcla de
bifenilos policlorados de las que se encuentran
comercialmente disponibles, o con una mezcla de
fenobarbital y -naftoflavona. Una vez obtenida la
fracción microsomal S-9, se fracciona y se conserva
a -80 ºC.
Mezcla S-9
En el momento de emplearlos se descongela un
volumen de S-9 de acuerdo a las necesidades del
ensayo y el volumen equivalente de mezcla de
cofactores (ver
Soluciones y medios de cultivo
). Se
prepara la mezcla S9: habitualmente se emplean
concentraciones entre 5 y 30 % v/v de fracción
microsomal en solución de cofactores. La elección
dependerá del tipo de producto a ensayar.
Recuperación de las cepas para su
caracterización fenotípica y para la realización
del ensayo
Para cada ensayo las cepas de
Salmonella
se
recuperan tomando una alícuota del cultivo
congelado y transfiriéndola a caldos nutritivos (con
el agregado de antibiótico en los casos que
corresponda para evitar la pérdida de los plásmidos)
de manera de obtener una densidad inicial
aproximada de células de entre 10
6
y 10
7
ufc por
ml. Los caldos se incuban a 35 – 37 °C hasta una
densidad de 1-2 10
9
ufc por ml. Se sugiere
realizar un recuento en placa, mediante diluciones
seriadas, para confirmar el número de bacterias
viables. De ahora en adelante estos caldos serán
denominados
Cultivos de trabajo
.
NOTA: el resto del cultivo congelado no se
reutiliza.
Caracterización fenotípica de las cepas de
Salmonella typhimurium
utilizadas para la
realización del ensayo
A continuación se describen los ensayos a
realizar con las cepas de
Salmonella typhimurium
que se utilizarán para la realización del ensayo con
el propósito de confirmar la identidad genética de
las mismas y su tasa de reversión espontánea al
carácter
his+.
Estos ensayos deben ser realizados cuando se
reciban cepas nuevas, cuando se preparen cultivos
para ser congelados o cuando se considere
necesario.
Procedimiento
Los ensayos se realizan con cultivos de toda la
noche en caldo nutritivo.
a) Dependencia de histidina (his)
Se realiza un aislamiento del cultivo en una
Placa MG-biotina
. Como todas las cepas utilizadas
de
Salmonella
son dependientes de histidina, no
debe observarse crecimiento luego de 48 horas de
incubación a 35 – 37,0 ºC.
b) Dependencia de biotina (bio)
Se realiza un aislamiento del cultivo en una
Placa MG-histidina
.
No debe observarse
crecimiento, excepto con la cepa TA102 que es
independiente de biotina, luego de 48 hs de
incubación a 35 - 37 ºC.
c) Dependencia de biotina e histidina (bio, his)
Se realiza un aislamiento del cultivo en una
Placa MG-biotina/histidina
. Debe observarse
crecimiento con todas las cepas luego de 24-48 hs
de incubación a 35 - 37 ºC..
d) Marcador rfa
Se realiza un aislamiento del cultivo en una
Placa MG-biotina/histidina
, o en una placa de agar
nutritivo. Se coloca un disco de papel de filtro
estéril en el centro de la siembra y se aplican sobre
él, 10 l de solución de cristal violeta al 0,1 %.
Todas las cepas deben mostrar una zona de
inhibición de crecimiento alrededor del disco
después de 24 horas de incubación a 35 - 37 ºC.
e) Deleción uvrB
Se realiza un aislamiento del cultivo en una
Placa MG-biotina/histidina
o en una placa de agar
nutritivo. Se irradia la placa con luz UV(C) durante
un período de tiempo previamente estandarizado, se
envuelve en papel de aluminio para evitar la
fotorreparación en contacto con la luz y se incuba a
35 - 37 °C. Excepto la cepa TA102 el resto de las
cepas de
Salmonella
no crecen después de la
irradiación.
f) Presencia del plásmido pKM101 (resistencia
a ampicilina)
Se realiza un aislamiento del cultivo en una
Placa MG-biotina/histidina/Ampicilina
o en una
placa de agar nutritivo con ampicilina (24 g por
ml). Se incuba a 35 - 37 ºC y debe observarse
crecimiento sólo con las cepas portadoras del
plásmido pKM101.
g) Presencia del plásmido pAQ1 (resistencia a
tetraciclina)
Se hace un aislamiento del cultivo en una
Placa
MG-biotina/histidina/Ampicilina
/
Tetraciclina
o en
una placa de agar nutritivo con tetraciclina (2 g
por ml). Se incuba a 35 - 37 ºC y debe observarse
crecimiento sólo con la cepa TA102 que es la única
portadora del plásmido pAQ1.
h) Frecuencia de mutación espontánea
Para determinar la frecuencia de mutación
espontánea de las cepas de
Salmonella
se emplea el