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por ml en dimetil sulfóxido.
Se pueden emplear otros mutágenos de probada
acción sobre la cepa de interés.
Las soluciones madres de los mutágenos deben
ser preparadas extremando las medidas de
seguridad dado la peligrosidad de las sustancias que
se manipulan. Se debe trabajar solamente bajo
campana de seguridad biológica y con la protección
adecuada.
En cada caso pesar la cantidad de droga
necesaria por diferencia en el recipiente en el cual
se preparará la solución, preferentemente frascos de
vidrio inactínico, estériles, agregar el volumen de
solvente estéril necesario y disolver. No filtrar.
Las soluciones madres de los mutágenos se
conservan a –20 °C y se diluyen a las
concentraciones de trabajo en el día del ensayo.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y
PLACAS
I. Medio E (50x) (sales VB ó Vogel-Bonner)
Sulfato de magnesio heptahidrato.................10 g
Ácido cítrico monohidrato .........................100 g
Fosfato dibásico de potasio anhidro ...........500 g
Fosfato de sodio y amonio tetrahidrato.......175 g
Agua destilada c.s.p....................................1 litro
Agregar los ingredientes a 650 ml de agua
caliente (aproximadamente a 40 °C) en el orden
indicado y mezclar con agitador magnético hasta
disolución total antes del agregado del componente
siguiente.
Completar a volumen con agua.
Fraccionar, esterilizar a 121 °C en autoclave
durante 15 minutos.
Conservar en envases
inactínicos a temperatura ambiente.
II. Agar blando suplementado con
histidina/biotina
Agar................................................................6 g
Cloruro de sodio.............................................6 g
Solución de histidina/biotina 0,5 mM
.......100 ml
Agua destilada c.s.p....................................1 litro
Autoclavar el agua con el agar y el cloruro de
sodio a 121°C durante 15 minutos. Conservar en
heladera. En el momento de usar fundir el medio
preparado en microondas o en agua hirviente y
agregar la
Solución estéril de histidina/biotina
0,5 mM
.
III. Caldo nutritivo
Seguir las instrucciones del fabricante que
figuran en el envase.
IV. Placas de agar nutritivo
Seguir las instrucciones del fabricante que
figuran en el envase. Luego de la esterilización
dejar entibiar y volcar en placas de Petri de plástico
estériles.
V. Placas de medio mínimo-glucosa (MG)
Agar...............................................................15 g
Medio E (50x)
.............................................20 ml
Solución de glucosa al 10 %
.......................50 ml
Agua destilada c.s.p....................................1 litro
Agregar el agar al agua y autoclavar. Dejar
enfriar hasta aproximadamente 60 °C. Agregar el
Medio E (50x)
y la
Solución de glucosa al 10 %
,
previamente esterilizados, mezclar cuidadosamente
y volcar en placas de Petri de plástico estériles.
VI. Placas de medio mínimo-glucosa (MG)
enriquecidas
NOTA: estas placas serán empleadas para el
aislamiento y la caracterización fenotípica de las
cepas de manera que en todos los casos deben
contener histidina en exceso (para su preparación se
emplea
Solución de histidina al 0,5 %
), a diferencia
de las placas que se emplean para la realización del
ensayo que sólo contendrán trazas de histidina para
permitir sólo unas pocas divisiones de las cepas
his -
].
Para preparar medio mínimo – glucosa
enriquecido agregar los siguientes volúmenes a
1 litro del medio agarizado preparado en
V. Placas
de medio mínimo-glucosa (MG)
:
Placas MG-biotina
Solución de biotina al 0,01 %
.......................8 ml
Placas MG-histidina
Solución de histidina al 0,5 %......................
8 ml
Placas MG-biotina/histidina
Solución de biotina al 0,01 %
……………...8 ml
Solución de histidina 0,5 %
..........................8 ml
Placas MG-biotina/histidina/Ampicilina
Solución de biotina al 0,01 %
.......................8 ml
Solución de histidina al 0,5 %
......................8 ml
Solución de ampicilina al 0,8 %
...................3 ml
(concentración final 24 µg por ml)
PlacasMG-biotina/histidina/Ampicilina/Te-
traciclina
Solución de biotina al 0,01 %
.......................8 ml
Solución de histidina al 0,5 %
......................8 ml
Solución de ampicilina al 0,8 %
...................3 ml
(concentración final 24 µg por ml)
Solución de tetraciclina al 0,08 %
...........0,25 ml
(concentración final 2 µg por ml)
Sistema exógeno de activación metabólica
El sistema de activación metabólica utilizado
habitualmente consiste en el sobrenadante de la
fracción obtenida a 9.000 G con un homogenato de