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VALORACION
Contenido de antigeno D
- Como una medida
de la uniformidad de la producción determinar el
contenido de poliovirus 1, 2, y 3 por un método
inmunoquimico adecuado (ver
635. Métodos
inmunoquímicos
) usando como referencia una
preparación calibrada en Unidades Antigeno D
apropiada. Para cada tipo de virus el contenido,
expresado en relación con la cantidad establecida en
el rotulo, esta dentro de los limites autorizados para
el producto.
Ensayo en vivo
Debe cumplir con el ensayo de in vivo para la
vacuna poliomielítica inactivada. La capacidad de
la vacuna para inducir la formación de anticuerpos
neutralizantes es determinada in vivo por uno de los
siguientes métodos:
Ensayo en pollos o cobayos
Preparar una serie adecuada de no menos de tres
diluciones de la vacuna a ser examinada usando una
solución salina buffereada adecuada. Distribuir
cobayos que pesen entre 250 y 350 g o pollos de 3
semanas de edad en grupos de diez animales, y
asignar a cada grupo cada una de las diluciones de
las vacunas. Inyectar intramuscularmente en cada
animal 0,5 ml de la dilución asignada a cada grupo.
Después de 5 a 6 días, sangrar los animales y
separar los sueros individuales. Examinar los sueros
para la presencia de anticuerpos neutralizantes en
una dilución 1/4 para cada uno de los tipos de
poliovirus humanos 1,2 y 3.
Mezclar 100 CCID
50
de virus con la dilución de
suero e incubar a 37 °C durante 4,5 y 6 horas. Si es
necesario para la consistencia de los resultados,
mantener a 5
±
3 °C durante 12 y 18 horas Inocular
las mezclas en cultivos celulares para la detección
de virus no neutralizados y leer los resultados hasta
los 7 días posteriores a la inoculación. Para cada
grupo de animales, anotar el número de suero que
tiene anticuerpos neutralizantes y calcular la
dilución de la vacuna que de una respuesta de
anticuerpo en el 50 por ciento de los animales.
Llevar a cabo en paralelo los ensayos control
usando una adecuada preparación de referencia. La
vacuna cumple con el ensayo si a una dilución de
1/100 o más produce una respuesta de anticuerpo
para cada uno de los tres tipos de virus en el 50 por
ciento de los animales.
Ensayo en ratas
Un método apropiado de ensayo in vivo consiste
en la
inyección intramuscular en la pata trasera de
no menos de tres diluciones de vacuna a ser
examinada y de referencia, usando para cada
dilución un grupo de 10 ratas de una cepa adecuada
libres de patógenos específicos. Es a menudo
necesario el uso de 4 diluciones para obtener
resultados validados para los 3 tres serotipos. El
número de animales en cada grupo deberá ser
suficiente para obtener resultados que cumplan con
los criterios de validez; grupos de 10 ratas son
usualmente suficientes aunque resultados validos
pueden resultar con menos animales por grupo. Si
son utilizados animales de diferente sexo, machos y
hembras deberán ser distribuidos equitativamente
en todos los grupos. Un peso de 175 y 250 g puede
ser adecuado. Es utilizada una inoculación de
0,5 ml por rata. El rango de dosis es elegido tal que
se obtenga una respuesta de dosis para los 3 tipos de
poliovirus. Después de 20 y 22 días se sangran los
animales. Se miden separadamente los anticuerpos
neutralizantes contra los 3 tipos de poliovirus
usando 100 CCID
50
de cepa Sabín como desafío de
virus, Vero o Hep2 como indicador de células y una
condición de neutralización de 3 horas entre 35 y
37 °C, si es necesario para la consistencia de los
resultados seguido de 18 horas entre 2 y 8 °C. Los
resultados son leídos después de la fijación y teñido
de las placas después de 7 días de incubación a
35 °C. Para un ensayo valido de anticuerpos, el
título de cada virus de desafío debe mostrar estar
dentro del rango de 10 CCID
50
a 1.000 CCID
50
y el
título de anticuerpo neutralizantes del suero control
debe estar dentro del doble de la dilución de la
media geométrica del título de suero. La potencia es
calculada por comparación de la proporción de
respondedores de la vacuna a ser examinada y la
vacuna de referencia por el método de probit o
después de la validación, usando un modelo de
líneas paralelas. En el caso de método de probit es
necesario establecer un título de anticuerpos
neutralizantes de corte para cada tipo de poliovirus
para definir un respondedor. Debido a la variación
interlaboratorio, no es posible definir valores de
corte que puedan ser aplicados a todos los
laboratorios. Preferentemente, los valores de corte
son determinados por cada laboratorio sobre la base
de una serie mínima de 3 ensayos con una vacuna
de referencia. El punto medio de la escala
logarítmica en base 2 de la media geométrica del
título mínimo y máximo de una serie de 3 o más
ensayos, es usado como valor de corte. Para cada
uno de los tres tipos de poliovirus, la potencia de la
vacuna no es significativamente menor que la de la
preparación e referencia.
El ensayo es no valido a menos que para la
vacuna a ser examinada y la de referencia la ED
50
se encuentre entre las dosis más bajas y más altas
dadas a los animales, el análisis estadístico no
muestre desviación significativa con respecto a la
linealidad ni al paralelismo y los límites de