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cualquier pico correspondiente a los conservantes y
a la protamina (picos que eluyen primero).
Insulina en el líquido sobrenadante
No más de 2,5 % del contenido total de insulina
para Preparaciones Inyectables de Insulina que son
suspensiones, salvo indicación contraria.
Procedimiento
- Centrifugar 10 ml de la
suspensión, a 1.500
g
durante 10 minutos y separar
cuidadosamente el líquido sobrenadante del residuo.
Determinar el contenido de insulina en el líquido
sobrenadante (
S
) por un método apropiado, por
ejemplo empleando las condiciones cromatográficas
descritas en
Valoración
. Calcular el porcentaje de
insulina en solución, por la fórmula siguiente:
100
S
/
T
en la cual
T
es el contenido total de insulina
determinada.
Impurezas con peso molecular mayor que la
insulina
Sistema cromatográfico
- Examinar la Insulina
correspondiente por cromatografía de exclusión por
tamaño molecular, empleando un equipo para
cromatografía de líquidos con un detector
ultravioleta ajustado a 276 nm y una columna de
30 cm
×
7,5 mm con fase estacionaria constituida
por gel de sílice hidrofílico de 5 a 10 µm de
diámetro en un grado apropiado para la separación
del monómero de Insulina de los dímeros y
polímeros. El caudal debe ser aproximadamente
0,5 ml por minuto.
Solución de arginina
- Preparar una solución de
L
-arginina en agua de aproximadamente 1 mg por
ml.
Fase móvil
-
Solución de arginina
, acetonitrilo
y ácido acético glacial (65:20:15). Filtrar y
desgasificar. Hacer los ajustes necesarios (ver
Aptitud del sistema
en
100 Cromatografía
).
Solución de resolución
- Emplear una solución
de Insulina de aproximadamente 4 mg por ml, que
contenga más de 0,4 % de proteínas de alto peso
molecular. Se puede emplear una Preparación
Inyectable de Insulina, tanto si es una solución
como una suspensión, que ha sido aclarada con una
cantidad suficiente de ácido clorhídrico 6 N, que
contenga el porcentaje indicado de proteínas de
elevada masa molecular o una solución preparada a
partir de Insulina en polvo, disuelta en ácido
clorhídrico 0,01 N. Esta última se puede preparar
dejando en reposo a temperatura ambiente durante
10 días aproximadamente, la solución preparada
con insulina en polvo. [NOTA: mantener la
temperatura de las soluciones entre 2 y 10 ºC y
emplearlas dentro de las 30 horas (Preparaciones
Inyectables de Insulina Soluble) o antes de 7 días
(otras Preparaciones de Insulina) de su preparación.
Si se emplea un inyector automático mantener la
temperatura entre 2 y 10 ºC].
Solución muestra
- Proceder según se indica en
Preparación muestra
en
Valoración.
Aptitud del sistema
(ver
100. Cromatografía
) -
Antes de emplear una columna nueva, equilibrar la
columna mediante al menos tres inyecciones
repetidas de
Solución de resolución
. La columna
está equilibrada cuando se obtienen resultados
repetitivos en dos inyecciones consecutivas. Si se
van a analizar las muestras que contienen
protamina, el equilibrado de la columna se realiza
empleando una solución que contenga protamina.
Cromatografiar la
Solución de resolución
y
registrar las respuestas de los picos según se indica
en
Procedimiento
: los tiempos de retención deben
ser aproximadamente entre 13 y 17 minutos para los
complejos de insulina poliméricos o complejos
covalentes de insulina-protamina; 17,5 minutos para
los dímeros de insulina covalentes; 20 minutos para
los monómeros de insulina y 22 minutos para las
sales. Si la solución en ensayo contiene
conservantes, como por ejemplo metilparabeno,
m
-
cresol o fenol, estos compuestos deben eluir más
tarde; la resolución
R
entre el pico de dímero y el
valle de separación entre los picos de monómero y
dímero debe ser mayor o igual a 2,0.
Procedimiento
- Inyectar en el cromatógrafo
aproximadamente 100
µ
l de la
Solución muestra
,
registrar el cromatograma aproximadamente
durante 35 minutos y medir las respuestas de los
picos. Ignorar cualquier pico con un tiempo de
retención mayor que el del pico de la Insulina. La
suma de las respuestas de los picos con un tiempo
de retención menor que el del pico principal no
debe ser mayor de 3,0 % (para las preparaciones
que contienen protamina) y del 2,0% (para las
preparaciones que no la contienen) de la respuesta
total de los picos.
Cinc total
No debe contener más de la cantidad indicada
en cada monografía.
Proceder del siguiente modo, salvo indicación
contraria de la monografía correspondiente.
MÉTODO A
Solución madre del estándar
- Disolver una
cantidad
apropiada
de
cinc
en
ácido
clorhídrico 0,01 N para obtener una solución de
aproximadamente 5 mg por ml.
Soluciones estándar
- Diluir la
Solución madre
del estándar
con ácido clorhídrico 0,01 N para
obtener soluciones de aproximadamente 0,4; 0,8;