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entre 2 y 8 °C.
Precaución
- Los animales a partir de los cuales
la Insulina Bovina o Porcina se obtiene deben cum-
plir los requerimientos de animales sanos apropiados
para el consumo humano, con la autorización de la
Autoridad Sanitaria competente. El proceso de ma-
nufactura deberá estar validado para demostrar la
apropiada inactivación o remoción de cualquier
contaminación por virus u otro agente infeccioso.
ENSAYOS
Identificación
A
- Examinar los cromatogramas obtenidos en
Valoración.
El tiempo de retención del pico de insu-
lina en el cromatograma obtenido a partir de la
Pre-
paración muestra
debe ser similar al obtenido con la
Preparación estándar A
o con la
Preparación están-
dar B
, acorde a la Insulina empleada.
B
- Examinar mediante mapeo peptídico.
Sistema cromatográfico
- Emplear un equipo para
cromatografía de líquidos con un detector ultravioleta
ajustado a 214 nm y una columna de 10 cm
×
4,6 mm
con fase estacionaria constituida por octadecilsilano
químicamente unido a partículas de sílice totalmente
porosas de 3
µ
m de diámetro. Mantener la columna a
40
°
C. El caudal debe ser aproximadamente 1 ml por
minuto. El cromatógrafo se debe programar del si-
guiente modo:
Tiempo
(minutos)
Solución A
(%)
Solución B
(%)
Etapa
0-60
90
→
30
10
→
70
Gradiente
lineal
60-65
30
→
0
70
→
100
Gradiente
lineal
65-70
0
100
Isocrático
Solución reguladora de sulfato
- Sulfato de amo-
nio 2,0 M y ácido sulfúrico 0,5 M (50:50). Filtrar y
ajustar a pH 2, si fuera necesario.
Solución A
- Mezclar 700 ml de agua, 200 ml de
Solución reguladora de sulfato
y 100 ml de acetoni-
trilo para cromatografía. Filtrar y desgasificar.
Solución B
- Mezclar 400 ml de acetonitrilo para
cromatografía, 400 ml de agua y 200 ml de
Solución
reguladora de sulfato
. Filtrar y desgasificar.
Fase móvil
- Emplear mezclas de
Solución A
y
Solución B
según se indica en
Sistema cromatográfi-
co
. Hacer los ajustes necesarios (ver
Aptitud del
sistema
en
100. Cromatografía
).
Solución de enzima
- Preparar una solución a par-
tir de un polvo liofilizado de
Staphylococcus aureus
cepa V-8
en agua grado HPLC para obtener una con-
centración de 1 mg por ml de proteasa la cual contie-
ne una actividad comprendida entre 500-1.000 unida-
des por mg de sólido.
Solución reguladora de HEPES
- Transferir
2,38 g de HEPES (ácido
N
-(2-hidroxietil)piperazina-
N'
-2-etanosulfónico) a un matraz aforado de 100 ml,
disolver con aproximadamente 90 ml de agua. Ajus-
tar a pH 7,5 con hidróxido de sodio 5 M, completar a
volumen con agua y mezclar.
Solución de digestión muestra
- Preparar una so-
lución de 2 mg por ml de la Insulina correspondiente
en ácido clorhídrico 0,01 N y transferir 500 µl de la
solución resultante a un recipiente con tapa apropiado.
Agregar 2,0 ml de
Solución reguladora de HEPES
y
400
µ
l de
Solución de enzima
, tapar e incubar a 25
°
C
durante 6 horas. Inhibir el proceso de digestión agre-
gando 2,9 ml de
Solución reguladora de sulfato.
Solución de digestión estándar
- Preparar al mis-
mo tiempo y de la misma manera que la
Solución de
digestión muestra
, pero empleando el estándar co-
rrespondiente.
Aptitud del sistema
(ver
100. Cromatografía
) -
Cromatografiar la
Solución de digestión muestra
y la
Solución de digestión estándar
y registrar las respues-
tas de los picos según se indica en
Procedimiento
: el
cromatograma obtenido a partir de la
Solución de
digestión muestra
debe tener un perfil cromatográfico
similar al obtenido con la
Solución de digestión
estándar
. En el cromatograma obtenido a partir de la
Solución de digestión estándar
identificar los picos
debidos a los fragmentos de digestión I, II y III. El
factor de asimetría de los picos de los fragmentos de
digestión II y III no debe ser mayor de 1,5; la resolu-
ción
R
entre los mismos no debe ser menor de 1,9.
[NOTA: el fragmento I consiste en los aminoácidos
comprendidos entre el aminoácido A5 y el A17 y
entre el aminoácido B1 y el B13. El fragmento II
consiste en los aminoácidos comprendidos entre el
aminoácido A18 y el A21 y entre el aminoácido B14
y el B21. El fragmento III consiste en los aminoáci-
dos comprendidos entre el aminoácido B22 y el B30.
El fragmento IV consiste en los aminoácidos com-
prendidos entre el aminoácido A1 y el A4. A y B son
las cadenas respectivas en la Insulina Bovina y Porci-
na]. [NOTA: el fragmento I eluye con el mismo
tiempo de retención en Insulina Bovina y en Insulina
Humana; el fragmento II eluye con el mismo tiempo
de retención en todas las Insulinas y el fragmento III
eluye con igual tiempo de retención en Insulina Bovi-
na y en Insulina Porcina].
Procedimiento -
Inyectar un blanco empleando el
programa de gradiente según se indica en
Sistema
cromatográfico
. Inyectar por separado en el cro-
matógrafo volúmenes iguales (aproximadamente
50 µl) de la
Solución de digestión estándar
y la
Solu-
ción de digestión muestra
, registrar los cromatogra-