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Internacional o una sustancia de referencia calibra-
da en Unidades Internacionales.
La Unidad Internacional es la actividad de factor
II de una cantidad establecida de Patrón Internacio-
nal que consiste en un concentrado liofilizado de
factor II humano. La equivalencia en Unidades
Internacionales del Patrón Internacional la establece
la Organización Mundial de la Salud.
El método cromogénico de valoración consiste
en dos pasos: la activación del factor II a factor IIa
dependiente de veneno de serpiente y el clivaje
enzimático de un sustrato cromogénico específico
para factor IIa, para dar un cromóforo que puede ser
cuantificado espectrofotométricamente. Bajo con-
diciones adecuadas, existe una relación lineal entre
la actividad del factor IIa y el clivaje del sustrato
cromogénico.
Reactivos
Solución reguladora para dilución
- Solución
que
contiene
6,06
g
por
litro
de
Tris(hidroximetil)aminometano, 17,53 por litro de
cloruro de sodio, 2,79 g por litro de ácido (etilendi-
nitrilo)tetracético y 1 g por litro de albúmina bovina
o albúmina humana. Ajustar a pH 8,4 si fuera nece-
sario, con ácido clorhídrico.
Veneno de víbora específico para activar fac-
tor II (Ecarina)
- Se trata de una proteína derivada
del veneno de víbora (
Echis carinatus
) que activa
específicamente el factor II. Reconstituir y almace-
nar según se indica en el rótulo.
Sustrato cromogénico para Factor IIa
- Sustra-
tos cromogénicos específicos para factor IIa tales
como:
H-D
-fenilalanil-
L
-pipecolil-
L
-arginina-4-
nitroanilida clorhidrato, 4-toluensulfonil-glicil-
prolil-
L
-arginina-4-nitroanilida,
H-D
-
ciclohexilglicil-
α
-aminobutiril-
L
-arginina-4-
nitroanilida, diacetato de
D
-ciclohexilglicil-
L-
alanil-
L
-arginina-4-nitroanilida. Reconstituir según
se indica en el rótulo.
Preparación estándar
- Diluir con
Solución re-
guladora para dilución
para obtener una solución
entre 0,015 y 0,16 UI por ml de
factor II. Preparar,
preferentemente por duplicado y en forma indepen-
diente, al menos tres diluciones en progresión ge-
ométrica o aritmética empleando el mismo solvente.
Preparación muestra
- Diluir con
Solución re-
guladora para dilución
para obtener una solución
entre 0,015 y 0,16 UI por ml de
factor II. Preparar,
preferentemente por duplicado y en forma indepen-
diente, al menos tres diluciones en progresión ge-
ométrica o aritmética empleando el mismo solvente.
Procedimiento
- Precalentar todas las solucio-
nes en un baño de agua a 37 °C inmediatamente
antes de realizar el ensayo. Las siguientes condi-
ciones de ensayo se utilizan para placas de
96 pocillos, si el ensayo se lleva a cabo en tubos, se
deben ajustar los volúmenes de manera que se man-
tengan las proporciones de la mezcla; se deben
realizar dos reacciones de cada dilución. En una
placa de 96 pocillos mantenida a 37 °C, agregar por
duplicado 25 µl de cada dilución de la
Preparación
muestra
o la
Preparación estándar
a cada uno de
los pocillos. Agregar 125 µl
de solución reguladora
a cada pocillo, luego 25 µl de
Veneno de víbora
específico para activar factor II
e incubar durante
exactamente 2 minutos. A cada pocillo agregar
25 µl de
Sustrato cromogénico para Factor IIa
. Se
admiten modificaciones de volúmenes de los reacti-
vos si con ellas se obtiene una mejor linealidad en
la relación dosis-respuesta. Determinar la veloci-
dad de cambio de absorbancia (ver
470
.
Espectrofo-
tometría ultravioleta y visible
) a 405 nm de forma
continua durante 3 minutos y obtener el promedio
de velocidad de cambio de absorbancia (
∆
A/min).
Si no se puede medir en forma continua, leer la
absorbancia a 405 nm a intervalos consecutivos
adecuados, durante 40 segundos, graficar la absor-
bancia en función del tiempo y calcular
∆
A/min
como la pendiente de la recta. El método se puede
adaptar a una reacción de punto final deteniendo la
reacción de hidrólisis tras un intervalo apropiado
bajando el pH por adición de un reactivo apropiado
como ácido acético (50 % v/v) o una solución de
citrato 1M a pH 3. Ajustar el tiempo de hidrólisis
para conseguir un incremento lineal del cromóforo
a lo largo del tiempo. Con los valores de
∆
A/min o
de A de cada dilución tanto de muestra como de
estándar, calcular la potencia de la muestra a exa-
minar y comprobar la validez del ensayo empleando
los métodos estadísticos habituales (ver
10. Análi-
sis estadístico de resultados de ensayos biológicos
).
VALORACIÓN DEL FACTOR VII DE
COAGULACIÓN SANGUÍNEA
El método para determinar la actividad de fac-
tor VII de coagulación es un ensayo cromogénico
en el cual se determina su actividad biológica como
complejo factor VIIa-factor tisular en la activación
del factor X en presencia de iones calcio y fosfolí-
pidos. La potencia de la preparación de factor VII
se estima comparando la cantidad necesaria para
alcanzar una cierta velocidad de formación del
factor Xa en una mezcla que contiene las sustancias
que intervienen en la activación del factor X y la
cantidad de Patrón Internacional o de una prepara-
ción de referencia, calibrada en Unidades Interna-
cionales, requerida para producir la misma veloci-
dad de formación de factor Xa. La Unidad Interna-
cional se define como la actividad del factor VII de
una cantidad establecida de Patrón Internacional,
que consiste en un concentrado de factor VII huma-