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inversamente proporcional entre la actividad de
heparina y el clivaje del sustrato cromogénico.
Reactivos
Solución reguladora para diluciones
- Solución
de
6,05 g
por
litro
de
Tris(hidroximetil)aminometano, si es necesario,
ajustar el pH a 8,4 con ácido clorhídrico.
Sustrato cromogénico del factor Xa
- Un sustra-
to cromogénico específico para factor Xa tal como
cloruro de
N
-benzoil-
L
-isoleucil-
L
-glutamil-glicil-
L
-arginina-4-nitroanilida. Reconstituir según se
indica en el rótulo.
Solución de antitrombina III
Solución de factor Xa bovino
Plasma humano normal
Preparación estándar
- Diluir con
Solución re-
guladora para diluciones
para obtener una solución
de 0,1 UI por ml de heparina.
Preparación muestra
- Diluir la preparación en
ensayo con
Solución reguladora para diluciones
para obtener una solución de 0,1 UI de heparina por
ml.
Procedimiento
- Las siguientes condiciones de
trabajo se aplican a placas de 96 pocillos. Si el
ensayo es llevado a cabo en tubos, los volúmenes
deben ser ajustados manteniendo la proporción en
la mezcla. Inmediatamente antes de iniciar el ensa-
yo, calentar todas las soluciones en un baño de agua
a 37 °C. Distribuir en una serie de tubos o pocillos
de la placa, preferentemente por duplicado, 20
µ
l de
Plasma humano normal
y 20
µ
l de
Solución de
antitrombina III
. Agregar a los tubos o pocillos
volúmenes crecientes en progresión aritmética (por
ejemplo 20
µ
l, 60
µ
l, 100
µ
l y 140
µ
l) de la
Prepa-
ración muestra
o la
Preparación estándar
y com-
pletar a un volumen final de 200
µ
l empleando
Solución reguladora para diluciones
(0,02 a
0,08 UI por ml de heparina en la mezcla final de
reacción). Las concentraciones se pueden modifi-
car si con ellas se obtienen una mejor linealidad en
la relación dosis-respuesta. Transferir 40
µ
l de cada
tubo o pocillo a una segunda serie de los pocillos,
agregar 20
µ
l de
Solución de factor Xa bovino
e
incubar a 37 °C durante 30 segundos.
Método de punto final
- Agregar 40
µ
l de una
solución 1 mmol por litro de
Sustrato cromogénico
del factor Xa
e incubar a 37 °C durante 3 minutos.
Finalizar la reacción disminuyendo el pH por agre-
gado de un reactivo adecuado tal como una solución
al 20 % v/v de ácido acético glacial y medir la ab-
sorbancia (ver
470. Espectrofotometría ultravioleta
y visible
) a 405 nm. En general, los tiempos de
reacción están comprendidos entre 3 y 15 minutos,
pero se admiten variaciones si así se obtiene una
mejora en la linealidad de la relación dosis-
respuesta.
Método cinético
- Agregar 40
µ
l de una solu-
ción 2 mmol por litro de
Sustrato cromogénico del
factor Xa
, incubar a 37 °C y cuantificar la velocidad
de liberación del sustrato, que debe ser inversamen-
te proporcional a la concentración de heparina,
midiendo en un espectrofotómetro el cambio de
absorbancia a una longitud de onda apropiada por
monitoreo continuo de la absorbancia. Determinar
la velocidad de cambio de absorbancia a 405 nm
continuamente por un período de tiempo y obtener
la velocidad media del cambio de absorbancia
(
∆
A/min).
Comprobar la validez del ensayo y calcular la
actividad de heparina en la preparación a examinar
por los métodos estadísticos habituales para un
ensayo de relación de pendientes (ver
10. Análisis
estadístico de resultados de ensayos biológicos
).
FACTORES DE COAGULACIÓN
ACTIVADOS
[NOTA: cuando corresponda, determinar la can-
tidad de heparina presente y neutralizarla por agre-
gado de sulfato de protamina
(10 μg de sulfato de
protamina neutralizan 1 UI de heparina).]
Preparar diluciones 1 en 10 y 1 en 100 de la
preparación en ensayo empleando una solución
reguladora tris(hidroximetil)aminometano pH 7,5
(ver
Soluciones reguladoras
en
Reactivos y Solu-
ciones
). Colocar en un baño de agua a 37 °C una
serie de tubos de poliestireno y agregar a cada tubo
0,1 ml de plasma pobre en plaquetas y 0,1 ml de
una dilución apropiada de cefalina
o sustituto de
plaquetas
.
Dejar en reposo durante 60 segundos.
Agregar a cada tubo 0,1 ml de una de las diluciones
o 0,1 ml de solución reguladora (tubo control).
Inmediatamente agregar a cada tubo 0,1 ml de una
solución de cloruro de calcio
3,7 g por litro (preca-
lentada a 37 °C) y medir el tiempo que transcurre
entre el agregado del cloruro de calcio y la forma-
ción de un coágulo. El ensayo debe realizarse en un
tiempo no mayor a 30 minutos luego de haber reali-
zado la dilución original. El ensayo solo es válido
si el tiempo de coagulación medido para el tubo
control esté entre 200 y 350 segundos.
VALORACIÓN DEL FACTOR II DE
COAGULACIÓN SANGUÍNEA
El método para determinar la actividad de fac-
tor II de coagulación es un ensayo cromogénico en
el cual se determina la actividad de factor II a través
de su activación específica y formación de fac-
tor IIa. La potencia de la preparación de factor II se
estima comparando su actividad con un Patrón