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3 - Impurezas relacionadas al principio activo
proteína.
La pureza de una preparación proteica obtenida
por tecnología de ADN recombinante debe ser
máxima. Los niveles permitidos de trazas de
contaminantes de cada producto serán especificados
en la monografía correspondiente.
En la
Tabla
se describen los tipos de impurezas
o contaminantes más frecuentes, indicando los
métodos
de
detección
más
idóneos:
Tabla
. Impurezas potenciales y/o agentes contaminantes.
Método de detección / cuantificación
Impurezas
Endotoxinas
Ensayo de endotoxinas bacterianas; ensayo de
piretógenos.
Proteínas de la célula hospedadora
SDS-PAGE
a
Otras impurezas proteicas
, inmunoensayos.
SDS-PAGE
a
, CLAE
b
ADN
, inmunoensayos.
Hibridación de ADN, espectrofotometría
ultravioleta, PCR
c
Proteínas mutantes
.
Mapeo peptídico, CLAE, IEF
d
Formil-metionina
, espectrometría de
masa, secuenciación de aminoácidos.
Mapeo peptídico, CLAE, espectrometría de masa,
degradación de Edman.
Metioninas odxidasas
Mapeo peptídico, análisis de aminoácidos,
CLAE/Fase reversa, degradación de Edman,
espectrometría de masa.
Clivado proteolítico
IEF, SDS-PAGE en condiciones reductoras, CLAE,
secuenciación de aminoácidos.
Agregados proteicos
SDS-PAGE, CLAE/SEC
Deamidación
e
IEF, CLAE, espectrometría de masa, secuenciación
de aminoácidos, degradación de Edman.
Anticuerpos monoclonales
SDS-PAGE, inmunoensayos.
Sustitución de aminoácidos
Análisis de aminoácidos, mapeo peptídico,
espectrometría de masa, degradación de Edman.
Contaminantes
Microbianos (bacterias, levaduras, hongos)
Control higiénico, ensayo de esterilidad, ADN (f)
Micoplasma
f
PCR, ADN (f)
Virus (endógenos y exógenos)
ECP
g
, Had
d
(virus exógenos solamente), act.
Transcriptasa reversa, MAP
i
, PCR.
a. Electroforosis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
b. Cromatografía líquida de alta eficacia.
c. Reacción en cadena de la polimerasa.
d. Isoelectroenfoque.
e. Cromatografía de exclusión molecular de alta resolución.
f. Fluorocromo unido a ADN.
g. Efecto citopático.
h. Hemoadsorción.
i. Producción de anticuerpos murinos.
Ensayo biológico para identidad y potencia
-
Los métodos para determinar la potencia de
productos biológicos obtenidos por técnicas de
ADN
recombinante
son
de
fundamental
importancia, pues miden la actividad del producto.
La actividad biológica, expresada en unidades
internacionales, debe conservar una estricta relación
directa con la masa del producto. Esto significa que
el efecto biológico medido (actividad) por unidad
de masa debe comportase como una constante
acotada dentro de límites claramente especificados
y autorizados. La actividad expresada por unidad
de masa se denomina actividad específica y
constituye un parámetro de identidad y/o pureza.
Esencialmente hay dos métodos para cuantificar
la actividad:
Análisis empleando un modelo animal
y
Análisis basados en cultivos de células
. Para
medir la masa se realizan
Análisis fisicoquímicos
.