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contaminaciones con otras líneas celulares o con
otros microorganismos.
Banco celular maestro (BCM)
- Es una
suspensión homogénea de células originales ya
transformadas con el vector de expresión
conteniendo el gen deseado, la cual es distribuida
en volúmenes iguales dentro de recipientes
individuales en condiciones definidas (como por ej.,
en nitrógeno líquido).
En algunos casos puede ser necesario establecer
BCM separados para el vector de expresión y la
célula hospedadora.
Se deben documentar
cuidadosamente la localización, identificación e
inventario de las ampollas individuales.
Se deben realizar todos los ensayos de identidad
del BCM necesarios para establecer las propiedades
significativas de las células (marcadores fenotípicos
y genotípicos relevantes) y la estabilidad de esas
propiedades a través del tiempo. Deben proveerse
datos demostrando que las células pueden ser
empleadas para el propósito deseado. También
deben obtenerse datos para demostrar el número de
copias e identidad del sistema de expresión, la
calidad y cantidad de la proteína que éste produce.
Debe confirmarse la secuencia de nucleótidos
del gen clonado en el estado de BCM.
Sin
embargo, en ciertos casos, como cuando se insertan
copias múltiples del gen clonado en el genoma de
una línea celular continua, la secuenciación puede
ser inapropiada. En tales circunstancias, puede ser
útil realizar un análisis de
Southern blot
sobre el
ADN celular total o bien el análisi de
Nolhern blot
o de la secuencia del ARNm.
Si fuera necesario generar un nuevo BCM por
transferencia de la construcción de expresión en
células hospedadoras seguida por una selección de
las células clonadas deseadas, se deben describir los
criterios de aceptación que permitan garantizar la
identidad del clon y la proteína producida en
referencia a la original.
Banco celular de trabajo (BCT)
- Es una
suspensión homogénea de células derivadas del
BCM luego de un número definido de pasajes,
distribuida en volúmenes iguales dentro de
recipientes individuales para su almacenamiento
(como por ej., en nitrógeno líquido).
La
localización, identificación e inventario de las
ampollas individuales deben ser cuidadosamente
documentados.
Para la elaboración de un lote de producto
biológico pueden ser empleados uno o más
recipientes del BCT. Si se emplean células de más
de un recipiente, las suspensiones celulares deberán
ser mezcladas en el momento de descongelarlas. El
nivel de duplicación de la población de las células
empleadas para la elaboración se basará en criterios
escritos establecidos por el elaborador asegurando
la integridad del sistema célula - producto.
En ambos bancos:
- Todos los recipientes deberán ser tratados de
la misma manera durante el almacenamiento y, una
vez retirados del lugar de depósito de células, los
mismos deberán ser descargados.
- Se recomienda que cada uno de los BCM y
BCT sean almacenados en dos o más áreas lo
suficientemente
separadas
dentro
de
las
instalaciones de producción, así como en un sitio
distante para evitar la pérdida de la línea celular.
Un banco celular puede ser empleado para la
elaboración en
Cultivos con número definido
pasajes
o bien en
Cultivos continuos
.
Cultivos con número definido de pasajes
- Este
método de cultivo es definido por un número
definido de pasajes o duplicaciones de la población,
el cual no debe ser superado durante el proceso de
elaboración. Se debe definir el máximo número de
duplicaciones, o pasajes, durante los cuales
rutinariamente el proceso de elaboración cumple
con los criterios expresados más arriba.
Deberán
describirse
en
detalle
los
procedimientos y materiales empleados para la
propagación de las células y para la inducción del
producto. En cada tanda de elaboración se deben
suministrar datos sobre el alcance y naturaleza de
cualquier contaminación microbiana de los
recipientes de cultivo inmediatamente antes de la
recolección, indicándose la sensibilidad de los
métodos empleados para detectarla.
Se deben presentar datos sobre la uniformidad
de las condiciones de fermentación y de la
propagación de los cultivos sobre el mantenimiento
del rendimiento del producto. Se deben establecer
los criterios que han de aplicarse para descartar
lotes de cultivo. Se debe determinar el número
máximo de duplicaciones celulares o cantidad de
pasajes permitidos durante la elaboración.
Se deben observar las características de la célula
hospedadora y el vector al final de los ciclos de
elaboración. De ser pertinente, se debe determinar
la secuencia de nucleótidos de la inserción que
codifica el producto derivado del ADN clonado, por
lo menos una vez después del cultivo en gran escala
de cada lote de siembra inicial.
Cultivos continuos
- A través de este método el
número de pasajes o duplicaciones de la población
no está definido ni restringido desde el comienzo de
la elaboración. El elaborador debe definir los
criterios adoptados tanto para la cosecha celular
como para la terminación del proceso de
elaboración. Durante la etapa de cultivo, el mismo
debe ser monitoreado, la frecuencia y el tiempo de
monitoreo requerido dependen de la naturaleza del