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La elección del organismo hospedador, sea éste
procariota (bacteria) o eucariota (células de
mamíferos, levaduras), es la resultante de diversos
factores que abarcan desde la complejidad de la
molécula a producir hasta la economía y eficiencia
del proceso de fermentación o cultivo celular.
El profundo conocimiento sobre la biología
molecular de
Escherichia coli
, hizo que
inicialmente fuese elegido este microorganismo en
diversos sistemas de producción en biotecnología.
Actualmente también existen en el mercado
diversos productos obtenidos por medio de cultivos
de células eucariotas modificadas genéticamente en
gran escala, para diversos procesos biotecnológicos
productivos.
Por lo tanto, podemos agrupar los procesos
biotecnológicos de acuerdo al organismo productor
seleccionado en:
A - Sistemas biotecnológicos procarióticos
(bacterias).
B - Sistemas
biotecnológicos
eucarióticos
(células de mamíferos y levaduras).
Los factores que influyen en la expresión de
genes extraños introducidos en un nuevo
hospedador son múltiples y muy complejos. Por lo
tanto, los procesos de este tipo deberán estar
diseñados para garantizar y controlar la estabilidad
de toda la construcción genética insertada a fin de
asegurar la homogeneidad y uniformidad de la
proteína producida por el hospedador a lo largo de
múltiples generaciones.
A - Sistemas biotecnológicos procarióticos
(bacterias)
El plásmido recombinante es el elemento clave
de esta tecnología. Contiene el gen previamente
aislado que codifica para la proteína de interés. Los
plásmidos están formados por ADN bacteriano, son
circulares, pequeños, extracromosomales y se
autorreplican.
Básicamente, esta tecnología involucra el
clivado enzimático específico del plásmido
bacteriano y la posterior inserción del gen de
interés. De esta manera se obtiene el plásmido
recombinante que al ser introducido en el
microorganismo hospedador, mediante el proceso
de transformación le confiere la propiedad de dirigir
u orientar la síntesis de la proteína deseada.
La expresión de proteínas recombinantes en
bacterias
ofrece
tanto
ventajas
como
inconvenientes. Como se mencionó anteriormente
la biología y fisiología bacterianas se conocen en
profundidad y existe amplia documentación que
demuestra el seguro y eficaz empleo de bacterias
como organismo hospedador.
Los productos procedentes de genes heterólogos
expresados en hospedadores extraños pueden diferir
de sus equivalentes naturales desde el punto de vista
estructural, biológico o inmunológico.
Esas
diferencias pueden surgir ya sea en el nivel
genético, con posterioridad a la traducción o a la
transcripción o durante el proceso de fermentación
y de purificación.
Por lo tanto, estos sistemas poseen limitaciones,
algunas de las cuales se enumeran a continuación:
a)
La proteína biosintetizada en el interior de
la célula se encuentra en un estado
químicamente reducido, sin la presencia de
los correspondientes puentes disulfuro que
estabilizan la estructura espacial de la
molécula nativa.
Es necesario efectuar
in vitro
, en
condiciones perfectamente definidas y
controladas, la oxidación que posibilite la
formación de los puentes disulfuro
intramoleculares y en consecuencia la
estabilización de la estructura molecular
terciaria.
De formarse sustancias no deseadas
(oligómeros,
puentes
disulfuro
intermoleculares y/o erróneos, etc.) las
mismas deberán ser eliminadas en el
proceso de purificación.
Además es
fundamental controlar la presencia de estas
formas moleculares en el producto final.
b)
Todas las proteínas producidas por
bacterias comienzan su secuencia de
aminoácidos con un residuo de
N
-formil-
metionina, el que no siempre es eliminado
por los sistemas enzimáticos específicos
(metilamino peptidasa-MAP), por lo que la
proteína resultante podría iniciar su
secuencia con esta modificación respecto a
la proteína nativa.
Los avances en la biología molecular de la
Escherichia coli
han conducido a la
obtención de la expresión de proteínas en
el espacio periplásmico de la bacteria.
Esta forma de expresión permite la
remoción de la metionina
N
-terminal no
deseada y la obtención de proteínas en
mayor grado de pureza.
c)
Durante el proceso de fermentación
bacteriana y en la etapa de aislamiento y
purificación posterior (
downstream
) debe
controlarse la acción proteolítica de exo y
endo-proteasas bacterianas, a fin de evitar
la
degradación
de
la
proteína
recombinante.
d)
Es necesario controlar la acción de las
deamidasas bacterianas que al hidrolizar