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24 horas a una temperatura de 32 a 35 °C.
Suspender el desarrollo del microorganismo así en
solución fisiológica (SR) estéril con la ayuda de
perlas de vidrio estériles. Transferir la suspensión
proveniente de los tubos de repique a una botella de
Roux que contenga 250 ml del
Medio 32
y dispersar
sobre toda la superficie con ayuda de las perlas de
vidrio estériles. Incubar de 5 a 7 días a una
temperatura de 32 a 35 °C.
El cultivo así obtenido se suspende en 50 ml de
agua estéril y se calienta a 65 °C durante
30 minutos en un baño termostatizado para eliminar
las formas vegetativas. Centrifugar a 3.000 rpm.
durante 20 minutos y descartar el sobrenadante.
Repetir este procedimiento no menos de tres veces,
a partir del agregado de
Agua purificada estéril
.
Luego de la última centrifugación, descartar el
sobrenadante, resuspender y llevar nuevamente a
65 °C durante 30 minutos.
Las esporas así
preparadas y almacenadas a una temperatura de 2 a
8 °C tienen una vida útil aproximada de 6 meses.
Verificar el rendimiento del proceso con coloración
para esporas y Gram (aproximadamente 80 % de
formación de esporas).
Debe realizarse un ensayo en placa para
asegurar la viabilidad de las esporas y determinar el
volumen de suspensión de esporas a agregar por
cada 100 ml de medio de cultivo.
Para ambos métodos de valoración, determinar
por medio de ensayos preliminares el volumen de
suspensión original a emplear como inóculo cada
100 ml de medio de cultivo, comenzando con el
volumen sugerido en la
Tabla 3
, de modo tal que se
obtengan como respuesta las zonas de inhibición
claramente definidas y de diámetro conveniente o
una turbidez apropiada a las diferentes dosis de
Sustancia de referencia
.
MÉTODOS GENERALES DE
VALORACIÓN MICROBIOLÓGICA
Método de difusión en agar
Procedimiento
- De acuerdo con el antibiótico a
valorar, fundir una cantidad suficiente de medio de
cultivo estéril según se indica en la
Tabla 3
, enfriar
a temperatura apropiada (por ej., entre 45 y 50 °C
para las formas vegetativas), inocular el medio y
agitar por rotación hasta lograr una suspensión
homogénea.
Emplear placas de Petri o bandejas
rectangulares de fondo plano y, trabajando sobre
una superficie plana y horizontal, verter en las
placas un volumen determinado de medio inoculado
para formar una capa uniforme de 2 a 5 mm de
espesor. Alternativamente, el medio puede estar
formado por dos capas, aunque sólo se inocule la
superior.
Para algunos microorganismos de ensayo, el
procedimiento puede mejorarse si las placas
inoculadas se dejan secar durante 30 minutos antes
de ser empleadas o si se refrigeran a 4 °C durante
varias horas.
Los reservorios empleados generalmente son
cilindros estériles de porcelana, de acero inoxidable
o de cualquier otro material apropiado, discos
estériles de papel o pocillos excavados en el agar.
El volumen que se carga en los reservorios debe ser
uniforme y con una tolerancia máxima de 5 %.
Emplear los solventes y las soluciones
reguladoras indicadas en la
Tabla 1
para preparar
las soluciones de la
Sustancia de referencia
y las
del antibiótico a ensayar. Para asegurar la validez
de la valoración, emplear por lo menos tres
concentraciones diferentes de la
Sustancia de
referencia
y tres concentraciones del antibiótico a
ensayar que presumiblemente tengan la misma
actividad que las soluciones de la
Sustancia de
referencia
.
Se deben emplear series de
concentraciones en progresión geométrica para
aplicar el método estadístico (ver
Cálculos
).
Distribuir las diluciones en cada placa de Petri o
en cada placa rectangular, según un plan
estadísticamente apropiado. En el caso de placas
pequeñas que no pueden contener más de seis
diluciones, alternar las diluciones del antibiótico y
las diluciones de la
Sustancia de referencia
, con el
fin de evitar cualquier interacción entre las
diluciones de mayor concentración.
Las placas de Petri deben incubarse sin
invertirla temperatura indicada ± 0,5 °C durante
18 horas aproximadamente. Es aconsejable un
período de predifusión antes de la incubación, que
puede oscilar de 30 minutos a 4 horas, a
temperatura ambiente o próxima a 4°C, según el
caso, esto tiene por finalidad reducir los efectos de
desfasaje de tiempo entre la aplicación de las
diferentes soluciones sobre las placas y así mejorar
la recta de regresión o bien obtener halos mayores y
más nítidos.
Empleando un instrumento de medición
apropiado, medir el diámetro de cada halo con una
precisión de hasta la décima de mm. Calcular la
actividad
empleando
métodos
estadísticos
apropiados (ver
Cálculos
). Emplear el suficiente
número de réplicas por concentración de antibiótico
en cada ensayo (no menos de cuatro placas) para
asegurar la precisión estadística.
Método turbidimétrico
Procedimiento
- Inocular un volumen de medio
de cultivo preferentemente conservado a una
temperatura de 2 a 8 °C, con un volumen
determinado de suspensión original estandarizada