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del microorganismo apropiado y emplearlo
inmediatamente.
Para preparar las soluciones de la
Sustancia de
referencia
y las soluciones del antibiótico a ensayar
en concentraciones que se consideren iguales,
emplear los solventes y las soluciones reguladoras
indicadas en la
Tabla 1
.
En tubos de ensayo estériles e idénticos,
transferir volúmenes iguales de cada solución y
agregar el mismo volumen de medio de cultivo
inoculado a cada uno de ellos (como por ej., 1 ml de
solución y 9 ml de medio).
Preparar simultáneamente dos tubos control que
contengan cada uno 9 ml de medio de cultivo
inoculado y 1 ml de solvente empleado (sin
antibiótico). Agregar inmediatamente a uno de
ellos 0,5 ml de formaldehído diluido. Este tubo
será empleado como blanco y sirve para calibrar el
espectrofotómetro. El tubo restante, constituye el
testigo de crecimiento que se emplea para
determinar la finalización de la incubación.
Para asegurar la validez de la valoración,
emplear por lo menos tres concentraciones
diferentes de la
Sustancia de referencia
y tres
concentraciones del antibiótico a ensayar que
presumiblemente tengan la misma actividad que las
soluciones de la
Sustancia de referencia
. Se deben
emplear series de concentraciones en progresión
geométrica para aplicar el método estadístico (ver
Cálculos
).
Ubicar todos los tubos, distribuidos al azar, en
cuadrado latino o en bloques aleatorios, en un baño
de agua a 37 °C (28 °C para
Candicidina
). Tomar
precauciones para asegurar una distribución
homogénea del calor e idéntico tiempo de
incubación, generalmente de 2 a 4 horas.
Luego de la incubación, detener la
multiplicación de los microorganismos por adición
al azar de 0,5 ml de formaldehído diluido a cada
tubo, excepto a los tubos rotulados como blanco.
Medir la turbidez del contenido de cada tubo con un
espectrofotómetro apropiado, a 530 nm. Calcular la
actividad empleando los método estadísticos
apropiados (ver
Cálculos
).
En cada ensayo, emplear el número de réplicas
por concentración de antibiótico (no menor de
cuatro tubos) para asegurar la precisión estadística.
[NOTA: el procedimiento para ambos métodos,
debe realizarse en condiciones asépticas].
ANALISIS ESTADÍSTICO
Curva Dosis-Respuesta
- Para comprobar si
cualquier ensayo en particular se está realizando por
el modelo de rectas paralelas, es necesario
examinar, previo a la realización de ensayos de
rutina, la relación dosis respuesta del componente
activo. Cuando la diferencia entre la relación del
logaritmo de la dosis y la respuesta de la
preparación patrón, se desvía notablemente del
efecto teórico, el modelo de rectas paralelas no es
válido para este ensayo en particular.
Debe
verificarse que en el intervalo de dosis empleado en
los ensayos, la relación entre el logaritmo de dosis y
la respuesta; es representada por una recta de
adecuada regresión y linealidad, con una
probabilidad de 0,05.
Diseños de ensayo
- La asignación de las
unidades experimentales a los diferentes
tratamientos pueden realizarse de distintas formas.
Diseño completamente aleatorio
-
Si la
totalidad de las unidades experimentales parece ser
razonablemente homogénea, sin indicación alguna
de que la variabilidad de la respuesta sea distinta
dentro de ciertos subgrupos reconocibles la
asignación de las unidades a los diferentes
tratamientos debe hacerse aleatoriamente.
Diseño en bloque aleatorio
- En este diseño, es
posible segregar una fuente identificable de
variación, tal como la variación entre placas de
Petri en un ensayo microbiológico por difusión. El
diseño requiere que todos los tratamientos se
apliquen el mismo número de veces en cada bloque
(placa de Petri) y es apropiado solamente cuando el
bloque es lo suficientemente grande como para
acomodar todos los tratamientos.
Diseño de cuadrado latino
- Este diseño es
apropiado cuando la respuesta puede verse afectada
por dos fuentes diferentes de variación, cada una de
las cuales puede asumir
k
niveles o posiciones
diferentes. En un ensayo en placa de un antibiótico,
los tratamientos pueden disponerse en una serie de
k
x
k
sobre una placa grande, realizándose cada
tratamiento una vez en cada fila y en cada columna.
El diseño es apropiado cuando el número de filas, el
número de columnas y el número de tratamientos
son iguales.
Pruebas de validez
El ensayo es estadísticamente válido si el
resultado del análisis de la varianza cumple como
mínimo con los siguientes requisitos:
1- Regresión: debe ser significativa para un
valor de p 0,05. El estadístico
F
calculado debe
ser mayor que el
F
que figura en la tabla de Fischer
para un valor de
6
0,05 para los grados de
libertad correspondientes al numerador y
denominador del estadístico
F
calculado.
2- Desvío del paralelismo: debe ser no
significativo para un valor de p
%
0,05. El
estadístico
F
calculado debe ser menor que el
F
que
figura en la tabla de Fischer para un valor de
%
0,05 para los grados de libertad correspondientes al