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500. IDENTIFICACION DE TETRACICLINAS
El siguiente ensayo se emplea para identificar
sustancias pertenecientes al grupo de las
tetraciclinas. A menos que se especifique de otro
modo en la monografía correspondiente, emplear
el
Método I.
Solución estándar
-
A menos que se
especifique de otro modo en la monografía
correspondiente, disolver y diluir la
Sustancia de
referencia
correspondiente a la sustancia a
identificar con el mismo solvente especificado
para la
Solución muestra
, para obtener una
solución con una concentración similar a la
obtenida para la
Solución muestra.
Solución muestra
-
Proceder según se
especifica en la monografía correspondiente.
Método I
Fase estacionaria
- Emplear una placa para
cromatografía en capa delgada (ver
100
.
Cromatografía
) recubierta con gel de sílice
octilsilanizado con indicador de fluorescencia de
0,25 mm de espesor.
Activar la placa por
calentamiento a 130 °C durante 20 minutos, dejar
enfriar y emplearla mientras esté tibia.
Fase móvil
-
Acido oxálico 0,5 M,
previamente ajustado a pH 2,0 con hidróxido de
amonio, acetonitrilo y metanol (80:20:20).
Solución de resolución
- A menos que se
especifique de otro modo en la monografía
correspondiente, preparar una solución en metanol
que contenga 0,5 mg de Clorhidrato de
Clortetraciclina SR-FA,
Hiclato
de
Doxiciclina SR-FA, Oxitetraciclina SR-FA y
Clorhidrato de Tetraciclina SR-FA por ml.
Procedimiento
- Aplicar por separado sobre la
placa 1 µl de la
Solución estándar
,
Solución
muestra
y
Solución de resolución
. Dejar secar las
aplicaciones y desarrollar los cromatogramas
hasta que el frente del solvente haya recorrido
aproximadamente tres cuartos de la longitud de la
placa. Retirar la placa de la cámara, marcar el
frente del solvente y dejarla secar al aire. Exponer
la placa a vapores de amoníaco durante 5 minutos
e inmediatamente examinar bajo luz ultravioleta a
366 mm: el cromatograma de la
Solución de
resolución
debe presentar manchas separadas y la
mancha principal obtenida a partir de la
Solución
muestra
debe ser similar en intensidad, apariencia
y valor de
R
f
Método II
Solución reguladora de pH 3,5
- Disolver
13,4 g de ácido cítrico anhidro y 16,3 g de fósfato
dibásico de sodio en 1 litro de agua y mezclar.
Fase estacionaria
- Emplear un papel para
cromatografía de 20 cm x 20 cm (Whatman N° 1
o equivalente). Impregnar la hoja con
Solución
reguladora de pH 3,5
y eliminar el exceso del
solvente presionando firmemente la hoja entre dos
papeles secantes no fluorescentes.
Fase móvil
- Nitrometano, cloroformo y
piridina (20:10:3). Emplear esta mezcla el mismo
día de preparada.
Solución mezcla
-
Solución estándar
y
Solución muestra
(50:50).
a la obtenida a partir de la
Solución
estándar.
Procedimiento
-
En una cámara para
cromatografía
ascendente
(ver
100.
Cromatografía
), colocar la
Fase móvil
hasta una
altura de 0,6 cm. Sobre la línea de siembra en la
hoja de papel y con una separación de 1,5 cm,
aplicar 2 µl de la
Solución estándar
,
Solución
muestra
y
Solución mezcla
. Antes de que las
aplicaciones se sequen completamente, colocar el
papel en la cámara cromatográfica de manera que
el borde inferior se introduzca en la
Fase móvil
.
Desarrollar los cromatogramas hasta que el frente
del solvente haya recorrido aproximadamente
10 cm, retirar la hoja de la cámara, marcar el
frente del solvente y exponerla a vapores de
amoníaco. Examinar bajo luz ultravioleta a
366 nm y visualizar la posición de las manchas
amarillas principales: el valor del
Rf
de la mancha
principal obtenida a partir de la
Solución muestra
y la
Solución mezcla
debe ser similar al obtenido a
partir de la
Solución estándar
.