Versión de HTML Básico
450. ESPECTROFOTOMETRIA DE FLUORESCENCIA
La espectrofotometría de fluorescencia es una
técnica empleada para determinar la concentración
de una sustancia comparando la intensidad de luz
fluorescente emitida por la misma con la emitida
por la
Sustancia de referencia
correspondiente, en
las mismas condiciones.
Aparato
- Se pueden emplear dos tipos de
aparatos, fluorómetro de filtro y espectro-
fluorómetro. El primero consta de los siguientes
componentes:
— Una fuente de radiación, generalmente una
lámpara de mercurio o tungsteno.
— Un filtro primario colocado entre la fuente de
radiación y la celda, para seleccionar la longitud de
onda de excitación.
— Una celda para contener la muestra.
— Un filtro secundario colocado entre la celda y
el detector, que actúa como un filtro interruptor fino
que permite transmitir la radiación fluorescente,
bloqueando en cambio la radiación dispersa.
— Un detector de fluorescencia colocado de
manera que forme un ángulo de 90 ° con respecto a
la dirección del haz de luz incidente, con el objeto
de minimizar la interferencia de la luz transmitida.
El espectrofluorómetro presenta los mismos
componentes que el fluorómetro de filtro, sólo que
los filtros se han reemplazado por sistemas
monocromadores como prismas o redes de
difracción, siendo frecuentemente empleada una
lámpara de arco de xenón a alta presión como
fuente de radiación.
Procedimiento
- Ajustar la lectura del aparato a
cero empleando el solvente o mezcla de solventes
indicados para disolver la muestra, a la longitud de
onda
especificada
en
la
monografía
correspondiente. Transferir a la celda un volumen
apropiado de una solución estándar preparada a
partir de la
Sustancia de referencia
correspondiente
y regular la sensibilidad del aparato de modo que la
lectura sea mayor a 50. Si el segundo ajuste se
realiza modificando la apertura de las rendijas,
ajustar nuevamente a cero el aparato y medir
nuevamente la intensidad de fluorescencia de la
solución estándar. Disolver la muestra en el
solvente o mezcla de solventes especificados en la
monografía correspondiente.
Transferir un
volumen apropiado de esta solución a la celda y
medir la intensidad de la luz emitida en las mismas
condiciones.
Calcular la concentración de la
sustancia en la solución muestra, por la fórmula
siguiente:
E ME
I Ic
/
en la cual
C
E
es la concentración de la solución
estándar,
I
M
es la intensidad de luz emitida por la
solución muestra e
I
E
Realizar el ensayo dentro del intervalo de
concentraciones en el cual la respuesta es lineal.
es la intensidad de luz emitida
por la solución estándar.