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orgánicos, detergentes, etc.]. Se deben tomar
precauciones para evitar la contaminación con
microorganismos u otros materiales extraños.
Preparación de extractos
- Transferir al envase
de extracción 20 ml de solución fisiológica (SR)
estéril o medio de cultivo para células de mamífero
sin suero como solvente de extracción y agregar las
piezas de la muestra individualmente. Repetir este
procedimiento para cada medio de extracción
requerido en el ensayo. Preparar un blanco con
20 ml de cada medio de extracción. Realizar la
extracción por calentamiento en autoclave a 121 °C
durante 60 minutos o en estufa a 70 °C durante
24 horas o a 50 °C durante 72 horas. [NOTA: si la
extracción se realiza a 37 °C durante 24 horas, en
estufa de cultivo, emplear el medio de cultivo
celular suplementado con suero.]
[NOTA: las condiciones de extracción no deben
causar alteraciones físicas como fusión o
aglomeración de los trozos del material plástico,
pues esto provocaría una reducción del área
expuesta; sólo es aceptable una leve adherencia del
material. Siempre agregar las piezas limpias
individualmente al medio de extracción.]
Enfriar a temperatura ambiente, pero no menor
de 20 °C. Agitar vigorosamente durante algunos
minutos y transferir, inmediatamente en forma
aséptica, cada extracto a un recipiente seco y estéril.
Almacenar los extractos a temperatura entre 20 y
30 °C y emplearlos dentro de las 24 horas.
ENSAYO DE DIFUSIÓN EN AGAROSA
Este ensayo se emplea para evaluar materiales
poliméricos o sus respectivos extractos. En este
ensayo la capa de agarosa protege a la monocapa
celular de un eventual daño mecánico, al mismo
tiempo que permite la difusión de productos
químicos cedidos por la muestra. Cuando se
analizan extractos, éstos se aplican sobre una
porción de papel de filtro atóxico.
Preparación muestra
- Emplear porciones de
la muestra que tengan una superficie plana no
menor de 100 mm
2
o preparar extractos según se
indica en
Preparación de extractos
y aplicar 50 µl
del extractivo sobre papel de filtro de superficie no
menor de 100 mm
2
Preparación de controles positivos y
negativos
-
Proceder según se indica en
Preparación muestra
.
.
Procedimiento
- Preparar monocapas en placas
de cultivo de 35 mm de diámetro, sembrando 2 ml
de la suspensión celular según se indica en
Preparación del cultivo celular
. Luego de la
incubación aspirar el medio de cultivo y
reemplazarlo con un medio preparado mezclando
partes iguales del medio de cultivo y de agarosa al
0,7 %.
Transferir la muestra, el
control positivo
y el
control negativo
, o sus respectivos extractos, por
duplicado, en contacto con la superficie de la
agarosa solidificada de diferentes placas. Incubar
todas las placas durante 24 horas a 37 ± 1 °C, en la
estufa de cultivo. Fijar, remover la capa de agarosa
y teñir con un colorante citoquímico. Examinar en
cada cultivo la reactividad alrededor de la muestra,
del
control positivo
y del
control negativo.
Interpretación de los resultados
– La
reactividad biológica (degeneración y malformación
celular) se describe y se califica en una escala de 0
a 4 (ver
Tabla 2
). Medir las respuestas obtenidas
con el
control negativo
, el
control positivo
y la
muestra. El ensayo es válido si la respuesta
observada con el
control negativo
es grado 0
(ninguna reactividad) y para el
control positivo
no
es menor que grado 3 (reactividad moderada). La
muestra cumple con los requisitos del ensayo si la
respuesta observada no es mayor de grado 2
(reactividad leve). Repetir el ensayo si no se
confirma su validez.
ENSAYO DE CONTACTO DIRECTO
Este ensayo se emplea para evaluar materiales
poliméricos. El procedimiento permite la
extracción y ensayo simultáneo de los componentes
químicos extraídos desde la muestra con un medio
suplementado con suero. Este ensayo no es
apropiado para materiales de muy baja densidad ni
alta densidad que puedan causar daño mecánico a
las células.
Preparación muestra
– Emplear porciones de
muestra que tengan superficies planas no menores
de 100 mm
2
Preparación de controles positivos y
negativos
– Proceder según se indica en
Preparación muestra
.
.
Procedimiento
– Preparar monocapas en
placas de cultivo de 35 mm de diámetro empleando
2 ml de la suspensión de células preparadas según
se indica en
Preparación del cultivo celular
. Luego
de la incubación, aspirar el sobrenadante del medio
de cultivo y reemplazarlo con 0,8 ml de medio de
cultivo fresco. Colocar en diferentes placas de
cultivo la muestra, el
control positivo
y el
control
negativo
, todos por duplicado. Incubar todas las
placas durante 24 horas a 37 ± 1 °C, en estufa de
cultivo. Fijar, lavar y teñir con un colorante
citoquímico. Examinar en cada cultivo la