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Concentración de endotoxina límite/ m
La concentración de endotoxina límite es igual a
la endotoxina límite especificada o calculada, en
UE/mg o UE/UI multiplicada por la concentración
de la solución muestra, en mg o UI de producto por
ml.
Preparar al menos cuatro soluciones
conteniendo
Endotoxina control
o
de referencia
a
una concentración de m.
Realizar el ensayo y calcular la media de la
concentración de endotoxinas. Cuando la media de
la concentración de endotoxina calculada es mayor
o igual a 50 % y menor a 200 % de m, la muestra
ensayada no contiene factores interferentes.
Cuando la media de la concentración de endotoxina
calculada es menor a 50 % o mayor 200 %, los
factores interferentes deben eliminarse según se
indica en
Método de gel en tubo
.
Cuando la media de la concentración de
endotoxina calculada es mayor a la concentración
más alta en la parte lineal de la curva de regresión
repetir el ensayo con un factor de dilución mayor de
la muestra a ensayar, calculado por la fórmula
siguiente:
Concentración de endotoxina límite/ m’
en la cual b < m’ < m.
Procedimiento
- Preparar las muestras, con las
modificaciones apropiadas para eliminar factores
interferentes y/o ajustar el pH, si fuera necesario.
En el protocolo de análisis deben prepararse las
siguientes soluciones y ensayar cada solución por
duplicado:
a
) solución de la muestra a ensayar, en la
dilución y condiciones que cumpla con el ensayo de
interferencias;
b
) solución de los controles positivos de la
muestra por duplicado conteniendo
Endotoxina
control
o
de referencia
a una concentración de m
o m’, en la misma dilución de la muestra a ensayar
que en (
a
);
c
) solución de
Endotoxina control
o
de
referencia
en
Agua reactivo
a una concentración de
a, b y de m o m´;
d
)
Agua reactivo
como control negativo.
Emplear los volúmenes indicados de las
soluciones descriptas, del lisado y del cromógeno
(de acuerdo a la forma de lectura, en microplaca o
microcubas) e incubar el tiempo especificado por el
elaborador.
Detener la reacción y medir la
absorbancia a la longitud de onda apropiada para la
reacción.
Para realizar la curva de calibración para el
análisis de las muestras, proceder según se indica en
Validación de la curva de calibración
. Calcular la
concentración de endotoxina de cada solución (
a
) y
(
b
) empleando la regresión lineal obtenida con los
controles (
c
).
El ensayo sólo es válido si se cumplen las
siguientes condiciones:
- El resultado del control de
Agua reactivo
es
negativo si no es mayor al límite del valor del
blanco obtenido en
Validación de la curva de
calibración
.
- El resultado de la solución control (
c
) cumple
con los requisitos de
Validación de la curva de
calibración
.
- La recuperación de endotoxina del control
positivo no debe ser menor de 50 % ni mayor de
200 %, calculada por la media aritmética de la
concentración de endotoxina de la solución (
b
)
luego de sustraída la media aritmética de la
concentración de endotoxina de la solución (
a
),
calculando el porcentaje de recuperación
dividiendo el resultado de la sustracción anterior
por m o m’ y multiplicando por 100.
El resultado de la muestra ensayada es aceptable
si la concentración de endotoxina de cada uno de
los duplicados es menor que m o m’ en UE/ml.
Si los resultados no son coincidentes, como por ej.,
si la concentración de una de las soluciones es más
baja y la otra más alta que este límite, debe repetirse
el ensayo. La muestra ensayada cumple con los
requisitos del ensayo si ambas soluciones, en la
repetición, cumplen con el límite del ensayo. Los
resultados deben ser expresados en las unidades de
endotoxinas límite especificadas (UE/mg, UE/ml o
UE/UI).
Interpretación
- La muestra cumple con los
requisitos del ensayo si la concentración de
endotoxina es menor que la especificada en la
monografía correspondiente.
METODOS CINETICOS:
turbidimétrico y cromogénico
Método turbidimétrico
- Mide el tiempo de
reacción necesario para el desarrollo de un grado
predeterminado de turbidez de una solución sobre la
cual se agrega lisado, empleando un aparato
apropiado.
Método cromogénico
- Mide el tiempo de
reacción necesario para el desarrollo de una
intensidad predeterminada de color después de la
liberación de un péptido cromogénico, empleando
un espectofotómetro a la longitud de onda
apropiada.
En ambos métodos cinéticos, el logaritmo del
tiempo de reacción guarda una relación lineal con el
logaritmo de la concentración de endotoxina.
Los criterios de validación de la curva de
calibración, la verificación de ausencia de factores
interferentes y la determinación de endotoxinas en