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de reacción con diluciones de
Endotoxina control
o
de referencia
con concentraciones de 2,0 ; 1,0 ;
0,5 ; 0 25 y los controles negativos de
Agua
reactivo
.
Calcular el contenido de endotoxina
según se indica en
Cálculos
.
Interpretación
- El ensayo sólo es válido
cuando los controles negativos (-) y positivos (+)
dan el resultado apropiado y la media geométrica en
el punto final de la
Endotoxina control
o
de
referencia
es mayor o igual a 0,5 , y menor o igual
a 2 . La muestra cumple con los requisitos del
ensayo si la concentración de endotoxina es menor
que
la
especificada
en
la
monografía
correspondiente.
Cálculos
Cálculo de la media geométrica
- El punto final
es la última dilución positiva en una serie de
concentraciones decrecientes de endotoxina.
Registrar la concentración en cada punto final, para
cada serie de diluciones.
Determinar el logaritmo de la concentración del
punto final (
e
) y calcular la media geométrica de la
concentración del punto final por la fórmula
siguiente:
f e
anti
/
log
en la cual
e
es la suma de los logaritmos de las
concentraciones finales de la serie de diluciones y
f
es el número de tubos de reacción en el punto final.
Cálculo del contenido de endotoxina
- Calcular
la concentración de endotoxinas en el producto a
ensayar, por la fórmula siguiente:
f d
anti
/
log
/
en la cual
d
es el logaritmo de los factores dilución
del producto (expresados como fracciones), en el
punto final para la muestra ensayada. [NOTA: los
resultados finales deben ser expresados en las
unidades de límite de endotoxina especificadas
(UE/ml o UE/mg o UE/Ul)].
MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
turbidimétrico y cromogénico
Método turbidimétrico
- Mide el cambio de
turbidez (por absorbancia o transmitancia) durante
la transformación final de la proteína coagulante en
coagulina. El valor de velocidad del cambio de
turbidez es función de la concentración de
endotoxina. Los ensayos deben ser realizados a la
temperatura de incubación de 37 ± 1 °C.
Método cromogénico
- Mide la concentración
de un cromóforo liberado a partir de un péptido
cromogénico contenido en una solución de
endotoxina incubada con un lisado y un sustrato
peptídico cromogénico (unido a
p
-nitroanilina),
empleando un espectrofotómetro a la longitud de
onda apropiada para la reacción. En casos de
interferencia, se puede copular el cromóforo de
p
-
nitroanilina por medio de una reacción de
diazotación. Existen metodologías de punto final y
cinéticas.
Método cromogénico de punto final
En este método se detiene la reacción
enzimática, a un tiempo preseleccionado, con una
cantidad apropiada de ácido acético.
La
concentración de endotoxina en la muestra o
diluciones apropiadas de la misma se determina
midiendo la absorbancia e interpolando la misma en
una curva de calibración preparada con soluciones
de
Endotoxina control
o
de referencia
en
Agua
reactivo
.
El pH de las soluciones debe estar
comprendido en el intervalo especificado por el
elaborador del reactivo. Los valores de pH deben
estar comprendidos entre 6,0 y 8,0. Si fuera
necesario, ajustar el pH antes del ensayo, mediante
el agregado de ácido clorhídrico 0,1 N o hidróxido
de sodio 0,1 N o soluciones reguladoras apropiadas,
estériles y libres de endotoxinas.
Los criterios de validación de la curva de
calibración, la verificación de ausencia de factores
interferentes y la determinación de endotoxinas en
las muestras son descriptos a continuación.
Validación de la curva de calibración
- Debe
realizarse cada vez que se emplee un nuevo lote de
lisado o cuando se modifique alguna condición que
pueda influir en el resultado del ensayo.
Preparar al menos cuatro series de soluciones de
por lo menos cuatro concentraciones de
Endotoxina
control
o
de referencia
en
Agua reactivo
, dentro del
intervalo especificado por el elaborador. La curva
debe incluir el límite ( ) especificado por el
elaborador y un blanco de reactivos. Realizar el
ensayo y graficar la absorbancia en función de la
concentración de endotoxina para cada tubo.
Efectuar una regresión de la curva de absorbancia
en función de concentración. La recta de regresión
debe tener una pendiente y linealidad significativas.
El coeficiente de correlación /r/ debe ser
%
0,98 en
valor absoluto en el intervalo de concentraciones de
endotoxinas indicados por el elaborador del lisado.
Determinar la concentración de endotoxina, m,
a partir de la media aritmética de la concentración
más alta ( a) y la concentración más baja ( b) para
la cual la curva de regresión es lineal, siendo todos
los valores expresados en UE/ml.
Factores interferentes
- La muestra debe ser
diluida de acuerdo a un factor de dilución calculado
a partir de la fórmula siguiente: