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330. ENSAYOS DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS
El ensayo de endotoxinas bacterianas se aplica a
la determinación o cuantificación de endotoxinas
provenientes de las bacterias Gram negativas,
empleando como reactivo, lisados de amebocitos
circulantes del cangrejo herradura de
Limulus
polyphemus
(ensayo LAL), de
Tachypleus
tridentatus
, etc. Cuando se enfrenta el reactivo a
soluciones que contienen endotoxinas produce
gelificación. La reacción requiere la presencia de
cationes bivalentes. La velocidad de la reacción
depende de la concentración de endotoxina, del pH
y de la temperatura. El lisado contiene un sistema
enzimático que actúa en cascada y que se activa
progresivamente en presencia de endotoxinas.
Como resultado final, la proteína coagulable
(coagulógeno) se transforma en un gel (coagulina),
siendo la base del método de gel en tubo.
Se han desarrollado otros métodos basados en
los cambios turbidimétricos que ocurren durante la
formación del gel y métodos cromogénicos,
basados en el desarrollo de color luego del clivaje
de un péptido sintético que contiene un cromóforo.
Estos métodos permiten estimaciones cuantitativas
del contenido de endotoxina, mientras que el
método de gel en tubo se emplea como ensayo
límite y también como método semicuantitativo.
Los métodos cuantitativos podrán emplearse si
satisfacen los requisitos para métodos alternativos
(ver
Consideraciones generales
) pero, en caso de
discrepancias, el resultado obtenido con el método
de gel en tubo es el definitorio.
Los métodos descriptos en este capítulo son:
a
) gel en tubo: ensayo límite y semicuantitativo;
b
) cromogénico de punto final;
c
) cinético cromogénico;
d
) cinético turbidimétrico.
El ensayo debe realizarse en condiciones tales
de evitar la contaminación microbiana.
Antes de llevarlo a cabo es necesario verificar:
1) que todos los materiales y reactivos a usar no
contengan endotoxinas bacterianas.
2) la sensibilidad del lisado, , de acuerdo a los
requisitos posteriormente descriptos en cada
método.
3) la ausencia de factores interferentes en las
muestras a analizar. Los resultados son válidos
siempre que se haya demostrado previamente que
las muestras a analizar no inhiban ni intensifiquen
la reacción.
Materiales y reactivos
Es necesaria la aplicación de tratamientos
controlados para la eliminación de endotoxinas.
Para el material de vidrio, el método más empleado
es el calentamiento a 250 °C por lo menos durante
30 minutos o 180 °C durante 3 horas.
Si se
emplean materiales plásticos de único uso
(microplacas, puntas para pipetas automáticas, etc.)
es necesario verificar que los mismos estén libres de
endotoxinas y que no interfieran con el ensayo.
Agua reactivo
- El agua empleada en este
ensayo debe estar libre de endotoxinas. Puede ser
preparada por destilación doble o triple y debe ser
recolectada
en
envases
convenientemente
despirogenados. Es necesario efectuar el control de
calidad de la misma, que debe cumplir con las
condiciones del ensayo.
Reactivo LAL
(Lisado de Amebocitos) -
Reconstituir el lisado según se indica en el rótulo
y/o prospecto. La sensibilidad del lisado, ,
establecida en el rótulo y que debe ser confirmada,
se expresa en Unidades de Endotoxina por ml
(UE/ml).
Otras soluciones
- El ácido clorhídrico 0,1 N y
el hidróxido de sodio 0,1 N, empleados para ajustar
el pH entre 6,0 y 8,0, deben prepararse con
Agua
reactivo
.
Endotoxina de referencia y Endotoxina control
-
Existe una
Endotoxina de referencia internacional
.
Se designa a la unidad de endotoxina como unidad
internacional, siendo la relación 1 UI = 1 UE. En
esta Farmacopea se designa a la unidad como UE
(Unidad de endotoxina).
La
Endotoxina control
es una preparación de
endotoxina distinta de la
Endotoxina de referencia
,
que se ha calibrado contra esta última. Las
endotoxinas deben ser reconstituidas con
Agua
reactivo
, mediante agitación con mezclador por
vórtice, de acuerdo a las indicaciones de los rótulos
y certificados de calibración. Estos concentrados se
pueden conservar en heladera el tiempo
especificado por el elaborador. Para la preparación
de soluciones de endotoxinas, agitar vigorosamente
con mezclador por vórtice los concentrados de
endotoxinas durante no menos de 5 minutos y
preparar diluciones seriadas en
Agua reactivo
con
tiempos de agitación que pueden variar entre
30 segundos y 1 minuto. No se deben almacenar
las diluciones porque pueden perder actividad por
adsorción al vidrio.
Límite de Endotoxinas
En las monografías individuales de materia
prima y producto terminado, bajo el subtítulo de
Ensayo de endotoxinas bacterianas
se indica el
límite de endotoxinas requerido para el producto.