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inmediato, insertar un peine limpio de
politetrafluoroetileno en la solución del gel de
apilamiento, evitando la formación de burbujas de
aire. Agregar más solución del gel de apilamiento
hasta rellenar completamente los espacios del peine.
Colocar el gel en posición vertical y dejar
polimerizar a temperatura ambiente.
Montaje del gel en el equipo de electroforesis
y separación electroforética
Solución reguladora de desarrollo SDS-
PAGE
-
Disolver en agua 151,4 g de
tris(hidroximetil)aminoetano, 721,0 g de glicina y
50,0 g de lauril sulfato de sodio, y completar a
5 litros con agua. Inmediatamente antes del uso,
diluir 10 veces su volumen con agua y mezclar. El
pH de esta solución debe estar comprendido entre
8,1 y 8,8.
Procedimiento
- Una vez completada la
polimerización (aproximadamente 30 minutos),
retirar
cuidadosamente
el
peine
de
politetrafluoroetileno y lavar los pocitos, de
inmediato, con agua o
Solución reguladora de
desarrollo SDS-PAGE
para eliminar la posible
acrilainida no polimerizada. Recortar los dientes
del gel de apilamiento, si fuera necesario, con una
aguja hipodérmica roma fijada a una jeringa.
Quitar las pinzas de uno de los lados cortos, retirar
el tubo con precaución y volver a colocarlas.
Proceder del mismo modo en el otro. Retirar el
tubo de la parte inferior del gel, montar el gel en el
aparato de electroforesis y agregar las soluciones
reguladoras en los compartimentos superior e
inferior. Eliminar las burbujas que se formen en la
parte inferior del gel, entre las dos placas de vidrio;
preferiblemente efectuar este procedimiento con
una aguja hipodérmica doblada fijada a una jeringa.
[NOTA: nunca realizar un predesarrollo sin
muestras ya que se destruye la discontinuidad de los
sistemas reguladores].
Antes de aplicar las
muestras, lavar cuidadosamente la ranura con
Solución reguladora de desarrollo SDS-PAGE
.
Preparar la solución muestra y la solución de
referencia en el medio recomendado y proceder
según
se
especifica
en
la
monografía
correspondiente. Aplicar el volumen apropiado de
cada solución en los pocitos del gel de apilamiento
y desarrollar la electroforesis. En ocasiones resulta
necesario modificar el tiempo y la relación
intensidad/voltaje, para obtener una separación
óptima. Comprobar que el frente del indicador se
desplace en el gel de resolución. Cuando el
indicador alcance la parte inferior del gel, detener la
electroforesis. Retirar el montaje del gel del
aparato y separar las placas de vidrio. Retirar los
espaciadores, cortar y tirar el gel de apilamiento y
proceder inmediatamente a la tinción.
DETECCIÓN DE PROTEÍNAS EN GELES
Todas las etapas de tinción de geles se realizan a
temperatura ambiente con agitación suave (por ej.,
en una placa de movimiento giratorio) en un
recipiente apropiado.
Tinción con Coomassie
- Es el método de
tinción de proteínas más empleado, con un nivel de
detección del orden de 1 a 10 g de proteína por
banda.
Solución colorante de Coomassie
- Disolver
1,25 g de Azul brillante de Coomassie R-250 en
1 litro de una mezcla de agua, metanol y ácido
acético glacial (5:4:1).
Solución de decoloración
- Emplear una mezcla
de agua, metanol y ácido acético glacial (5:4:1).
Procedimiento
- Sumergir el gel en un exceso
de
Solución colorante de Coomassie
y dejar en
contacto por lo menos durante 1 hora. Eliminar la
Solución colorante de Coomassie
. Decolorar el gel
con un exceso de
Solución de decoloración
.
Cambiar la
Solución de decoloración
varias veces
hasta que las bandas de proteínas teñidas se
distingan nítidamente sobre un fondo claro. Cuanto
más se lave, menor será la cantidad de proteína que
se pueda detectar. La decoloración se puede
acelerar agregando en la
Solución de decoloración
algunos gramos de resina de intercambio aniónico.
[NOTA: las soluciones ácido-alcohólicas
empleadas en este procedimiento no fijan por
completo las proteínas en el gel. Esto puede
conducir a la pérdida de algunas proteínas de bajo
peso molecular durante el proceso de tinción y
decoloración de geles finos. La fijación permanente
se obtiene introduciendo el gel en una mezcla de
agua, metanol y ácido tricloroacético (5:4:1)
durante 1 hora antes de introducirlo en la
Solución
colorante de Coomassie
.]
Tinción con plata
- Es el método más sensible
para proteínas teñidas en geles y permite detectar
bandas que contengan 10 a 100 ng de proteína.
Reactivo de nitrato de plata
- A una mezcla de
3 ml de amoníaco concentrado y 40 ml de hidróxido
de sodio 1 M, agregar 8 ml de una solución al 20 %
de nitrato de plata, gota a gota, y con agitación.
Diluir con agua a 200 ml.
Solución de fijación
. - A 250 ml de metanol,
agregar 0,27 ml de solución de formaldehído al
35 % y diluir con agua a 500 ml.
Solución de desarrollo
- Diluir 2,5 ml de una
solución al 2 % de ácido cítrico y 0,27 ml de
solución de formaldehído al 35 % con agua a
500 ml.