Versión de HTML Básico
Solución de bloqueo
- Emplear una solución al
10 % v/v de ácido acético.
Procedimiento
- Introducir el gel en exceso en
Solución de fijación
durante 1 hora. Eliminar la
Solución de fijación
, agregarla de nuevo e incubar
otra vez durante por lo menos 1 hora o durante toda
la noche, si es conveniente. Eliminar la
Solución de
fijación
y lavar el gel con abundante agua durante
1 hora. Embeber el gel durante 15 minutos en una
solución de glutaraldehído al 1 % v/v. Lavar el gel
dos veces durante 15 minutos con abundante agua.
Embeber el gel en
Reactivo de nitrato de plata
recientemente preparado, durante 15 minutos, en la
oscuridad.
Lavar el gel tres veces durante
5 minutos con abundante agua, sumergirlo durante
aproximadamente 1 minuto en
Solución de
desarrollo
hasta que se obtenga una tinción
satisfactoria. Detener el desarrollo por incubación
en
Solución de bloqueo
durante 15 minutos y lavar
el gel con agua.
DESECADO DE GELES DE
POLIACRILAMIDA SDS TEÑIDOS
Los geles se someten a diferentes tratamientos,
dependiendo del método empleado para teñirlos.
Cuando se emplea
Tinción con Coomassie
, luego de
la etapa de decoloración, colocar el gel en una
solución al 10 % de glicerol durante por lo menos
2 horas, siendo posible una incubación durante toda
la noche. Cuando se emplea
Tinción con plata
, al
finalizar el proceso de lavado, sumergir los geles en
una solución al 2 % de glicerol, durante 5 minutos.
Sumergir dos hojas de celulosa porosa en agua
durante 5 a 10 minutos, colocar una de las hojas en
el cuadro de secado, levantar el gel cuidadosamente
y colocarlo sobre la hoja de celulosa. Eliminar las
burbujas de aire que eventualmente puedan haber
sido retenidas y algunos ml de agua a lo largo de los
bordes del gel. Recubrir con la segunda hoja de
papel y eliminar nuevamente las posibles burbujas
de aire retenidas. Colocar en estufa para completar
el secado o dejar secar a temperatura ambiente.
DETERMINACIÓN DE PESO MOLECULAR
El peso molecular de las proteínas se determina
mediante comparación de sus respectivas
movilidades con las de varios marcadores de peso
molecular conocido. Para la calibración de los
geles se dispone de mezclas de proteínas de peso
molecular conocido, que permiten obtener una
tinción uniforme.
Las soluciones madre
concentradas de proteínas de peso molecular
conocido preparadas en la solución reguladora de
muestra se aplican en el mismo gel contiene la
muestra de la proteína a analizar.
Inmediatamente
después
del
desarrollo
electroforético, señalar la posición del indicador,
azul de bromofenol, para identificar el frente de
migración de los iones. Después de la tinción,
medir las distancias de migración de cada banda
proteica (marcadores y muestras).
Dividir la
distancia de migración de cada proteína por la
distancia de migración del indicador. Las distancias
de migración normalizadas así obtenidas se
denominan movilidades relativas de las proteínas
(relativas al frente del indicador) y, por convención,
se expresan como
R
f
. Graficar el logaritmo de los
pesos moleculares relativos (M
r
) de las proteínas
patrón en función de los valores de
R
f
. Los pesos
moleculares desconocidos se pueden determinar por
regresión lineal o por interpolación a partir de las
curvas obtenidas; los valores obtenidos para las
muestras se deben encontrar contenidos en la parte
lineal del gráfico.
VALIDACIÓN DEL ENSAYO
El ensayo sólo es válido si las proteínas
empleadas como marcadores de pesos moleculares
se distribuyen a lo largo del 80 % de la longitud del
gel y además si, en el intervalo de separación
requerido, la separación obtenida para las bandas de
proteínas relevantes, presenta una relación lineal
entre el logaritmo de peso molecular y el
R
f
Cuando se trabaja en las condiciones validadas,
es posible cuantificar las impurezas por
normalización con relación a la banda principal,
empleando un densitómetro. En estos casos, se
debe comprobar la linealidad de las repuestas.
. En la
monografía correspondiente se especifican los
requisitos de validación adicionales referentes a la
solución muestra.
CUANTIFICACIÓN DE IMPUREZAS
Cuando en la monografía se especifica el límite
de impurezas, se debe preparar una solución de
referencia correspondiente al nivel de impureza
especificado, por dilución de la solución muestra.
En el electroforegrama obtenido a partir de la
solución muestra, ninguna impureza (ni ninguna
banda, a excepción de la principal) puede ser más
intensa que la banda principal obtenida a partir de la
solución de referencia.