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CARACTERíSTICAS DE LA
ELECTROFORESIS EN GEL CON SISTEMA
REGULADOR DISCONTINUO
El método electroforético más usado para la
caracterización de mezclas complejas de proteínas
se basa en el empleo de un sistema regulador
discontinuo consistente en dos geles contiguos pero
distintos: un gel inferior, llamado gel de separación
o de resolución, y otro superior, gel de apilamiento.
Estos dos geles presentan porosidad, pH y fuerzas
iónicas diferentes. Además se emplean iones con
diferentes movilidades iónicas en el gel y en la
solución reguladora. La discontinuidad del sistema
provoca una concentración de las muestras de
mayor tamaño en el gel de apilamiento y por lo
tanto se mejora la resolución. Cuando se aplica la
corriente eléctrica, se desarrolla un gradiente de
potencial negativo a través de la solución muestra
que conduce a las proteínas hacia el gel de
apilamiento. Los iones glicinato contenidos en la
solución reguladora empujan a las proteínas hacia el
gel de apilamiento. Se forma rápidamente una zona
de frente móvil cuya cabecera está constituida por
iones cloruro de alta movilidad, seguidos de iones
glicinato más lentos en la cola. Se produce un
gradiente de alto voltaje localizado entre los frentes
iónicos de cabeza y cola, provocando que los
complejos SDS-proteína se concentren en una zona
muy estrecha (apilamiento) y migren entre las fases
de cloruro y glicinato. Independientemente del
volumen de muestra aplicado, el conjunto de
complejos SDS-proteína se condensa en una región
muy estrecha y penetran en el gel de separación en
forma de banda estrecha, bien definida y de alta
densidad proteica. El gel de apilamiento, de tamaño
de poro, grande, no retarda la migración de la
mayoría de las proteínas y actúa principalmente
como medio anticonvectivo. En la interfase de
ambos geles, las proteínas experimentan un
incremento brusco de retardo electroforético debido
al menor tamaño de poro del gel de resolución.
Una vez que se encuentran en este gel, las proteínas
continúan avanzando lentamente por el efecto de
tamización molecular que ejerce la matriz. Los
iones glicinato migran por delante de las proteínas,
por lo que éstas se mueven en un medio de pH
uniforme formado por el tris(hidroximetil)amino-
metano y la glicina. La tamización molecular hace
que la separación de los complejos SDS-polipéptido
se base en sus correspondientes pesos moleculares.
PREPARACIÓN DE GELES DE
POLIACRILAMIDA SDS VERTICALES CON
SISTEMA REGULADOR DISCONTINUO
Preparación de los geles
En un gel de poliacrilamida con sistema
regulador discontinuo, se recomienda verter el gel
de resolución, dejar polimerizar y a continuación
verter el gel de apilamiento ya que la constitución
de los dos geles de archilamida-bisacrilamida es
diferente.
Preparación del gel de resolución
- En un
erlenmeyer, preparar el volumen apropiado de la
solución de acrilamida que contenga la
concentración deseada para el gel de resolución,
empleando los valores indicados en la
Tabla 1
.
Mezclar los componentes en el orden indicado.
Antes del agregado de la solución de persulfato de
amonio y del tetrametiletilendiamina (TEMED),
filtrar la solución, si fuera necesario, empleando
vacío, a través de una membrana de acetato de
celulosa (de 0,45 mm de diámetro); mantener la
solución bajo vacío por rotación de la unidad de
filtración hasta que no se formen más burbujas.
Agregar las cantidades apropiadas de solución de
persulfato de amonio y de TEMED indicadas en la
Tabla 1
, agitar y verter rápidamente en el espacio
de separación entre las dos placas de vidrio del
molde. Dejar espacio suficiente para el gel de
apilamiento (la longitud de un diente del peine más
1 cm). Empleando una pipeta de vidrio de punta
larga, recubrir la solución con isobutanol saturado
con agua. Dejar el gel en posición vertical a
temperatura ambiente para que se produzca la
polimerización.
Preparación del gel de apilamiento
– Luego de
la polimerización completa del gel de resolución
(aproximadamente 30 minutos), retirar la capa
superior de isobutanol y lavar varias veces con agua
la parte superior del gel para eliminar la capa de
isobutanol y la posible acrilamida no polimerizada.
Eliminar la mayor cantidad posible de líquido de la
superficie del gel eliminando el resto de agua con la
ayuda de un papel de filtro.
En un erlenmeyer, preparar un volumen
apropiado de solución que contenga la
concentración requerida para el gel de resolución,
según se indica en la
Tabla 2
.
Mezclar los
componentes en el orden indicado. Antes del
agregado de la solución de persulfato de amonio y
del tetrametiletilendiamina, filtrar la solución, si
fuera necesario, empleando vacío, a través de una
membrana de acetato de celulosa (de 0,45 mm de
diámetro); mantener la solución bajo vacío por
rotación de la unidad de filtración hasta que no se
formen más burbujas. Agregar las cantidades
apropiadas de solución de persulfato de amonio y
de TEMED, indicadas en la
Tabla 2
, agitar y verter
rápidamente en el espacio de separación entre las
dos placas de vidrio del molde, directamente sobre
la superficie del gel de resolución polimerizado. De