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metanol. Recolectar todo el eluido en un balón de
25 ml con un pequeño reservorio en el fondo.
Llevar a sequedad en un evaporador rotatorio a
60 °C. Disolver el residuo en 100 l de una
mezcla de benceno y acetonitrilo (98:2).
Solución del estándar interno
- Mezclar 10 l
de la muestra con 4 l de la
Solución estándar
.
Revelador
- Solución de ácido sulfúrico al
30 % v/v.
Procedimiento
- Aplicar por separado sobre la
placa 10 l de la
Solución muestra
, 2; 4; y 6 l de
la
Solución estándar
y 10 l de la
Solución del
estándar interno
. Dejar secar las aplicaciones y
desarrollar los cromatogramas hasta que el frente
del solvente haya recorrido aproximadamente
11 cm. Retirar la placa de la cámara y marcar el
frente del solvente.
Secar la placa al aire
protegida de la luz. Examinar la placa bajo luz
ultravioleta a 360 mm: las aflatoxinas B
1
y B
2
aparecen como manchas azules y las G
1
y G
2
como manchas verdes. Los valores de
R
f
son
aproximadamente: 0,4 para G
2
, 0,5 para G
1
, 0,6
para B
2
y 0,7 para B
1
Sm PCV
. Para confirmar pulverizar
sobre la placa con
Revelador
. Dejar secar a la
oscuridad y observar bajo luz ultravioleta a 360
nm: las cuatro aflatoxinas se observan como
manchas amarillas. Calcular la concentración de
cada aflatoxina, en g por kg, en la porción de
muestra tomada, por la fórmula siguiente:
en la cual
P
es el volumen, en l, de
Solución
estándar sembrado
,
C
es la concentración de
aflatoxina en la
Solución estándar
(B
1
y G
1
1 g
por ml y B
2
y G
2
Método II
0,5 g por ml),
V
es el volumen,
en l, de la dilución final del residuo,
S
es el
volumen de
Solución muestra sembrado
y
m
es el
peso del residuo en g.
Determinación de aflatoxinas por
cromatografía líquida
Este método se emplea para determinar
aflatoxinas en formas farmacéuticas de uso oral y
tópica sin tratamiento térmico antes de la
administración.
Sistema cromatográfico
- Emplear un equipo
para cromatografía de líquidos equipado con un
detector de fluorescencia capaz de proveer una
excitación de 360 mm y una emisión de 440 nm y
una columna 15 cmx 4 mm con fase estacionaria
constituida por octadecilsilano químicamente
unido a partículas de sílice porosa de 5 m de
diámetro.
Mantener
la
columna
a
aproximadamente 30 °C.
El caudal es de
aproximadamente 1,0 ml por minuto.
Fase móvil
- Agua, acetonitrilo y metanol
(40:10:10) filtrado y desgasificado. Hacer los
ajustes necesarios (ver
Aptitud del sistema en 100.
Cromatografía
).
Solución madre del estándar
- Proceder según
se indica en
Método I
.
Solución estándar
- Transferir alícuotas de
cada una de las
Soluciones madre del estándar
valoradas a matraces apropiados y preparar una
solución concentrada que contenga 300 ng por ml
de B
1
, 50 ng por ml de B
2
, 150 ng por ml de G
1
y
50 ng por ml de G
2
empleando una mezcla de
benceno y acetonitrilo (98:2).
Evaporar a
sequedad en estufa de vacío a 60 °C y diluir el
residuo con 1 ml de acetonitrilo. Transferir las
alícuotas indicadas en la
Tabla 2
de esta solución
a matraces aforados de 10 ml, llevar a volumen
con acetonitrilo para obtener las soluciones
indicadas en la
Tabla 2
.
[NOTA: a partir de la
Tabla 2
preparar al menos
cinco
Soluciones estándar diluidas
incluyendo una
solución cuya concentración represente el límite de
detección del sistema cromatográfico empleado].
Columna cromatográfica
- Proceder según se
especifica en
Método I
.
Solvente de extracción
- Proceder según se
especifica en Método I.
Solución de derivatización
- Mezclar 10 ml de
ácido trifluoroacético con 5 ml de ácido acético
glacial y 35 ml de agua bidestilada (este volumen es
suficiente para realizar 70 derivatizaciones).
Solución muestra
- Transferir 25 g de muestra
previamente homogeneizada y molida (tamiz
N° 20), exactamente pesados, a un erlenmeyer de
500 ml. Agregar cantidad suficiente de
Solvente de
Soluciones estándar
diluidas
Alícuota
( l)
Concentración de aflatoxinas
( l por ml)
B
B
1
G
2
G
1
2
A
270
81
13,5
40,5
13,5
B
180
4,5
9
27
9,
C
90
27
4,5
13,5