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110. DETERMINACIÓN DE AFLATOXINAS
Precauciones
-
Las aflatoxinas son sustancias
carcinogénicas. Se debe trabajar bajo campana,
evitar la inhalación, el contacto con la piel y en lo
posible no abrir los envases originales hasta que
se realice la disolución
.
[NOTA: para descontaminar el material
empleado, sumergirlo en solución de hipoclorito
de sodio al 2 %, dejar actuar durante 18 horas
como mínimo, agregar acetona al 5 %, dejar
actuar durante 30 minutos y lavar con agua].
Método I
Determinación de aflatoxinas por
cromatografía en capa delgada
Este método se emplea para detectar
aflatoxinas en drogas vegetales destinadas a la
elaboración de infusiones, cocimientos y todos
aquellos productos que sufren un tratamiento
térmico antes de la administración.
Fase estacionaria
- Emplear una placa para
cromatografía en capa delgada (ver
100.
Cromatografía
) recubierta con gel de sílice para
cromatografía de 0,25 mm de espesor.
Fase móvil
- Cloroformo y acetona (9:1).
Solución reguladora de fosfato pH 7,4
-
Transferir 1,0 g de cloruro de potasio, 1,0 g de
fosfato monobásico de potasio, 5,8 g de fosfato
dibásico de sodio anhidro y 40,0 g de cloruro de
sodio a un matraz aforado de 5 litros. Agregar
aproximadamente 4,5 litros de agua y disolver.
Ajustar a pH 7,4 empleando ácido clorhídrico o
hidróxido de sodio, según sea necesario. Diluir a
volumen con agua y ajustar nuevamente el pH.
Soluciones madre del estándar
- Disolver el
contenido del envase de cada aflatoxina en una
mezcla de benceno y acetonitrilo (98:2). Diluir
cuantitativamente y en etapas con el mismo
solvente hasta obtener soluciones con una
concentración de 8 a 10 g por ml de cada
aflatoxina.
Agitar vigorosamente la solución
durante 1 minuto. Determinar la absorbancia de
cada solución a 350 nm, con un espectrofotómetro
apropiado, empleando una mezcla de benceno y
acetonitrilo (98:2) como blanco. Calcular la
concentración de la respectiva aflatoxina, en mg
por ml, por la fórmula siguiente:
AP
1000
en la cual
P
es el peso molecular asignado de la
aflatoxina correspondiente y
es la absortividad
molar para cada aflatoxina en la mezcla de
benceno y acetonitrilo (98:2). Los valores de
P
y
se encuentran en la
Tabla 1
.
[NOTA: almacenar las aflatoxinas en el
envase original a 20 °C. Las
Soluciones madre
del estándar
de cada aflatoxina deben llevarse a
sequedad bajo atmósfera de nitrógeno a
temperatura ambiente o en estufa de vacío a
60 °C. Preservar las toxinas así obtenidas en un
envase con cierre hermético-protegido de la luz a
20 °C. Estas soluciones son estables por 1 año o
más].
Tabla 1.
Aflatoxina
P
B
312
1
19.800
B
314
2
20.900
G
328
1
17.100
G
330
2
18.200
Solución estándar
– Transferir alícuotas de
cada una de las
Soluciones madre del estándar
valoradas, a un envase de 3 ml de vidrio
inactínico, agregar cantidad suficiente de una
mezcla de benceno y acetonitrilo (98:2) para
preparar una solución que contenga 1 mg por ml
de B
1
, 0,5 mg por ml de B
2
, 1 mg por ml de G
1
y
0,5 mg por ml de G
2
Columna cromatográfica
- Emplear una
columna cromatográfica de inmunoafinidad con
anticuerpos monoclonales específicos para
aflatoxinas.
.
Solvente de extracción
- Disolver 5 g de
cloruro de sodio en 200 ml de una mezcla de
metanol y agua (70:30).
Solución muestra
- Transferir 25 g de la
muestra, previamente molida y tamizada con
tamiz N° 20, exactamente pesados, a un
erlenmeyer de 500 ml.
Agregar cantidad
suficiente de
Solvente de extracción
para que toda
la muestra quede embebida. Agitar 1 hora en un
agitador mecánico o 5 minutos en licuadora a alta
velocidad. Filtrar y recolectar el filtrado en un
erlenmeyer de 250 ml.
Transferir 80 ml del
extracto, exactamente medidos, a un erlenmeyer
de 250 ml, agregar 160 ml de
Solución reguladora
de fosfato pH 7,4
. Agitar y filtrar a través de una
membrana filtrante de porosidad entre 0,8 y
1,6 m. Aplicar 120 ml del filtrado (equivalente a
5 g de muestra) a través de la
Columna
cromatográfrca
, asegurando un caudal de 1 ó
2 gotas por segundo y cuidando que la columna
no se seque. Lavar la columna con 20 ml de
Solución reguladora de fosfato pH 7,4
y secar
haciendo pasar aire a través de la misma con una
jeringa vacía. Descartar el líquido de lavado.
Eluir las aflatoxinas adsorbidas en la columna
lentamente por acción de la gravedad con 2 ml de