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inyectores automáticos mejoran la reproducibilidad
de las inyecciones y reducen la necesidad del
estándar interno.
A partir de los resultados obtenidos calcular el
contenido de la o las sustancias a ensayar.
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE
ALTA EFICACIA
La Cromatografía de líquidos de alta eficacia,
CLAE, (comúnmente llamada HPLC en inglés), es
denominada también Cromatografía líquida de alta
resolución o rendimiento. La Cromatografía líquida
de alta eficacia tiene la ventaja de que las
separaciones pueden tener lugar a temperatura
ambiente para muchas sustancias. Por lo tanto, las
sustancias no volátiles o térmicamente inestables,
pueden cromatografiarse sin descomposición o
necesidad de hacer derivados volátiles.
La afinidad de una sustancia por la fase
estacionaria y, por consiguiente, su tiempo de
retención en la columna, se controla variando la
polaridad de la fase móvil mediante el agregado de
un segundo y, a veces, un tercer o hasta un cuarto
componente.
Aparato
- Consta de:
- Un reservorio de fase móvil.
-
Un sistema de bombeo que impulsa
cantidades exactas de fase móvil desde el
Reservorio de fase móvil
a la columna mediante
tuberías y uniones aptas para soportar altas
presiones. Los sistemas modernos constan de una o
varias bombas dosificadoras, controladas por
computadora, que pueden programarse para variar
la composición de la fase móvil cuando se trabaja
con gradiente o para mezclar los componentes de la
fase móvil cuando se trabaja en condiciones
isocráticas. Generalmente se trabaja con gradiente
cuando la muestra es muy compleja o contiene
sustancias que difieren mucho en su factor de
capacidad.
Las bombas pueden dar origen a caudales de
hasta 10 ml por minuto y generar presiones de hasta
6.000 psi. Sin embargo, los caudales típicos son de
1 a 2 ml por minuto, con presiones no mayores a
2.000 ó 2.500 psi. Las bombas empleadas para el
análisis cuantitativo son de material resistente tanto
al ataque químico como al ataque mecánico y son
capaces de entregar la fase móvil a una velocidad
constante, con fluctuaciones mínimas, durante
períodos prolongados.
- Un sistema de inyección empleado para
introducir la muestra.
- Una columna donde se produce la separación
efectiva de los componentes de la muestra
inyectada.
Las fases estacionarias para la cromatografía de
líquidos en fase reversa constan de una fase
orgánica químicamente unida a sílice u otros
materiales. Las partículas son generalmente de 3 a
10 mm de diámetro pero los tamaños pueden llegar
hasta 50 mm o más para las columnas preparativas.
Las partículas recubiertas con una capa delgada de
fase orgánica tienen una baja resistencia a la
transferencia de masa y, por lo tanto, se obtiene una
transferencia rápida de las sustancias entre la fase
estacionaria y la fase móvil. La polaridad de la fase
estacionaria depende de la polaridad de sus grupos
funcionales que van desde el octadecilsilano
relativamente no polar a grupos nitrilo muy polares.
Por lo general, las columnas empleadas para las
separaciones analíticas tienen diámetros internos de
2 a 5 mm; para la cromatografía preparativa se
emplean columnas de diámetro mayor. En algunos
casos las columnas pueden calentarse para mejorar
la eficiencia durante la separación, pero rara vez se
las emplea a temperaturas por encima de los 60 °C,
debido a la potencial degradación de la fase
estacionaria o a la volatilidad de la fase móvil. Las
columnas se emplean a temperatura ambiente, a
menos que se especifique de otro modo en la
monografía correspondiente.
- Un detector. Se emplean generalmente:
Detector espectrofotométrico: consta de una
celda de flujo colocada a la salida de la columna.
Un haz de radiación ultravioleta pasa a través de la
celda de flujo en forma perpendicular a la dirección
del flujo de la fase móvil e incide en el fotodetector.
A medida que las sustancias eluyen de la columna,
pasan a través de la celda y absorben la radiación,
lo que da lugar a cambios cuantificables en el nivel
de energía. Este detector es el más empleado.
Existen detectores de longitud de onda fija,
variable y múltiple. Los detectores de longitud de
onda fija operan a una sola longitud de onda, en
general 254 nm, emitida por una lámpara de
mercurio de baja presión. Los detectores de
longitud de onda variable contienen una frente
continua, como una lámpara de deuterio o de xenón
de alta presión y un monocromador o un filtro de
interferencia
que
generan
una
radiación
monocromática a una longitud de onda seleccionada
por el analista. Los detectores de longitud de onda
variable pueden programarse para variar la longitud
de onda durante el análisis. Los detectores de
longitud de onda múltiple miden la absorbancia a
dos o más longitudes de onda simultáneamente.
Detectores por arreglo de diodos: el haz de luz
continua atraviesa la celda. Luego la radiación es
resuelta en sus longitudes de onda constitutivas que
son detectadas individualmente mediante el arreglo
de diodos. Estos detectores adquieren los datos de