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absorbancia sobre el intervalo total UV-visible y,
por lo tanto, proveen al analista varias longitudes de
onda seleccionadas y espectros de los picos eluidos.
Los arreglos de diodos tienen, por lo general, menor
relación señal-ruido que los detectores de longitud
de onda fija o variable y, por lo tanto, son menos
apropiados para el análisis de sustancias presentes
en bajas concentraciones.
Detectores de índice de refracción: miden la
diferencia entre el índice de refracción de la fase
móvil sola y el de la fase móvil que contiene las
sustancias cromatografiadas según eluyan de la
columna. Se emplean para detectar sustancias que
no absorben radiación ultravioleta, pero son menos
sensibles que los detectores ultravioleta. Son
sensibles a pequeños cambios en la composición del
solvente, el caudal y la temperatura, por ello se
emplea una celda de referencia que contiene la fase
móvil para obtener una línea de base satisfactoria.
Detectores fluorométricos: son sensibles a las
sustancias fluorescentes o que puedan convertirse
en derivados fluorescentes, ya sea mediante la
transformación química de la sustancia o acoplando
reactivos fluorescentes en grupos funcionales
específicos.
Detectores electroquímicos, potenciométricos,
voltamétricos o polarográficos: son útiles para la
cuantificación de sustancias que pueden oxidarse o
reducirse en un electrodo de trabajo.
Estos
detectores son selectivos, sensibles y confiables
pero las fases móviles deben estar libres de oxígeno
disuelto o iones metálicos oxidantes.
Debe
emplearse una bomba sin pulso y el pH, la fuerza
iónica y la temperatura de la fase móvil deben
permanecer constantes. Los electrodos de trabajo
son propensos a la contaminación por los productos
de reacción con las consiguientes variaciones en las
respuestas.
Los detectores electroquímicos con
electrodos de pasta de carbono pueden emplearse
ventajosamente para medir cantidades muy
pequeñas, del orden de los ng de sustancias
fácilmente oxidables en particular fenoles y
catecoles.
-Un registrador que recibe la información del
detector y realiza la impresión del cromatograrna.
Los dispositivos modernos almacenan la señal de
salida del detector permitiendo reprocesar el
cromatograma luego de cambiar las variables de
integración.
También pueden emplearse para
programar el cromatógrafo controlando la mayoría
de las variables y automatizando el proceso.
Procedimiento
- La composición de la fase
móvil influye significativamente en la resolución de
las sustancias en la muestra.
[NOTA: deben
emplearse solventes de grado HPLC y reactivos de
alta pureza].
Equilibrar la columna con la fase móvil y
preparar las soluciones estándar y muestra según se
especifique en la monografía correspondiente. Las
soluciones deben ser filtradas.
Adecuar el sistema cromatográfico según se
especifica en la monografía correspondiente.
Inyectar por separado las soluciones estándar y
muestra, registrar los cromatogramas y medir las
respuestas de los picos según se especifique en la
monografía correspondiente.
A partir de los valores obtenidos calcular el
contenido de la o las sustancias a ensayar.
Los métodos generalmente empleados son los
de estándar externo y estándar interno. En general
se obtienen resultados confiables por los sistemas
de estándar externo, especialmente cuando se
emplean inyectores automáticos.
Este método
compara directamente la respuesta obtenida
cromatografiando
separadamente
soluciones
estándar y muestra. En otros casos se obtienen
mejores resultados empleando el sistema de
estándar interno. En este caso se agrega una
cantidad conocida de una sustancia no interferente,
el estándar interno, a las soluciones muestra y
estándar.
Luego se compara la relación de
respuesta
estándar/estándar
interno
y
muestra/estándar interno.
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
En la Cromatografía de exclusión las sustancias
presentes en la muestra se separan de acuerdo a su
tamaño. Los compuestos cuyas dimensiones sean
mayores que el tamaño de poro de la fase
estacionaria atraviesan la columna sin ser retenidos
y eluyen al volumen de exclusión
V
O
(volumen
muerto). Los compuestos cuyas dimensiones sean
menores que el tamaño de poro de la fase
estacionaria se introducen en los poros, quedan
retenidos por más tiempo y eluyen al volumen total
de permeación
V
T
La Cromatografía de exclusión se puede dividir
en Cromatografía de permeación de geles que
emplea fases móviles orgánicas no polares y
rellenos hidrofílicos y Cromatografía por filtración
de geles que emplea fases móviles acuosas y
rellenos hidrofóbicos.
(cuanto menor sea dicho tamaño
más tiempo quedan retenidos en los poros y
viceversa).
Aparato
- Emplear el cromatógrafo descrito en
Cromatografía de líquidos de alta eficacia
.
- Columna.
[NOTA: si fuera necesario,
controlar la temperatura de la columna].
El material de relleno puede ser un soporte
blando, como por ej., un gel o un soporte rígido,