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Como fase móvil emplear el solvente o la solución
especificada en la monografía correspondiente.
Equilibrar la fase móvil con agua si la fase
estacionaria es una solución acuosa o si la fase
estacionaria es un líquido orgánico polar, equilibrar
con ese líquido.
Cuando la valoración o el ensayo requieren el
empleo de varias columnas cromatográficas
colocadas en serie, cuando se especifique el
agregado de la fase móvil en porciones o el cambio
en la composición de la misma, dejar que cada
porción drene completamente a través de la
columna y lavar el vástago con fase móvil antes del
agregado de cada porción.
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
El mecanismo predominante en Cromatografía
en papel es la partición, ésto se debe a que el papel
posee un contenido natural de agua que puede ser
considerada como fase estacionaria. Sin embargo,
en la práctica, las separaciones frecuentemente son
el resultado de la combinación de efectos de
adsorción y partición.
Cromatografía descendente
Aparato
- Consta de:
- Una cámara con cierre hermético para
permitir la saturación con los vapores de la fase
móvil, generalmente construida de vidrio, acero
inoxidable o porcelana y diseñada de manera que
permita seguir el proceso sin necesidad de abrirla.
- Un bastidor de material resistente a la
corrosión, aproximadamente 5 cm más corto que la
altura interior de la cámara. El bastidor sirve de
soporte a las cubetas que contienen la fase móvil y
de las cuales se suspenden las hojas de papel.
- Una o más cubetas de vidrio o de material
inatacable por la fase móvil.
- Varillas de vidrio, colocadas en forma paralela
al borde de cada cubeta para mantener suspendidas
la hoja de papel.
- Hojas de papel cromatográfico de textura y
espesor apropiados.
Procedimiento
- Trazar una línea transversal,
cerca de uno de los extremos del papel, de modo
que cuando se sumerja en la fase móvil quede a
unos pocos centímetros por debajo de la varilla de
vidrio.
Disolver la muestra en un solvente
apropiado. Aplicar un volumen de la solución así
obtenida que contenga aproximadamente entre 1 y
20 mg de la sustancia a ensayar sobre la línea
anteriormente trazada y un volumen similar de la
Sustancia de referencia
dejando no menos de 3 cm
entre cada aplicación. Las aplicaciones no deben
formar una mancha mayor de 6 a 10 mm de
diámetro, para ello aplicar las soluciones en
porciones sucesivas dejando secar luego de cada
aplicación.
Sujetar el papel por el extremo donde se aplicó
la muestra dentro de la cubeta. El papel debe pasar
por encima de la varilla colocada en el borde de la
cubeta y debe colgar libremente en la cámara, sin
tocar su fondo o sus paredes.
Colocar una cantidad apropiada de fase móvil en
el fondo de la cámara y cerrarla herméticamente.
Dejar la cámara en estas condiciones durante un
período que permita que el ambiente se sature y el
papel se equilibre con el vapor de la fase móvil. La
saturación de la cámara puede favorecerse mediante
el revestimiento de las paredes internas con un
papel humedecido en fase móvil.
Colocar la fase móvil en la cubeta y cerrar la
cámara herméticamente. Dejar descender la fase
móvil por el papel, hasta que haya recorrido la
distancia deseada. Retirar el papel de la cámara,
marcar rápidamente el frente del solvente y dejar
secar.
Observar los cromatogramas directamente o
revelar la posición de las manchas empleando
reactivos apropiados. Comparar los cromatogramas
obtenidos a partir de la muestra y la
Sustancia de
referencia
.
La sección del papel que contiene la sustancia o
sustancias aisladas puede cortarse y eluirse con un
solvente apropiado. La solución resultante puede
ser valorada mediante técnicas químicas o
instrumentales apropiadas empleando
Sustancias de
referencia
, tratadas de la misma manera que la
muestra, en un intervalo apropiado dé
concentraciones para realizar una curva de
calibración.
Cromatografía ascendente
Aparato
- Emplear el aparato descrito en
Cromatografía descendente
.
Procedimiento
- Aplicar la muestra y la
Sustancia de referencia
según se indica para el
Procedimiento
en
Cromatografía descendente
.
Transferir una cantidad apropiada de fase móvil
para cubrir el fondo de la cámara. Colocar la
cubeta vacía en el fondo de la cámara. Colocar el
papel empleando un soporte apropiado dentro de la
cubeta vacía, procurando que no toque las paredes
de la cámara. Cerrarla herméticamente y dejarla en
estas condiciones durante un período que permita
que el ambiente se sature y el papel se equilibre con
el vapor de la fase móvil. Colocar la fase móvil en
la cubeta y cerrar la cámara herméticamente. Dejar
que el solvente ascienda por el papel hasta que haya
recorrido la distancia deseada. Retirar el papel de la
cámara, marcar el frente del solvente y dejar secar.