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coincidir en color y valor de
R
f
En Cromatografía en columna, Cromatografía
en papel y Cromatografía en capa delgada, las
sustancias pueden ser localizadas por: (a)
observación directa con luz visible o luz
ultravioleta, si las sustancias poseen color o
producen fluorescencia; (b) observación con luz
visible o ultravioleta, después de agregar un
reactivo que reaccione con las sustancias separadas;
(c) mediante un contador Geiger-Müller o con
técnica autorradiográfica, cuando se trabaja con
sustancias radiactivas o (d) por estimulación o
inhibición del desarrollo microbiano, colocando
trozos de papel que contienen las sustancias
separadas en medios de cultivo apropiados.
, y el
cromatograma de la mezcla debe mostrar una única
mancha.
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
La Cromatografía en columna se emplea para la
separación de sustancias en escala preparativa.
Cromatografía de adsorción
Preparación de la columna
- Emplear un tubo
cromatográfico, cilíndrico, de vidrio o del material
especificado en la monografía correspondiente,
generalmente de 10 a 30 mm de diámetro interno y
de 150 a 400 mm de largo. En su extremo inferior,
el tubo se angosta formando un tubo de salida que
generalmente posee un diámetro interno de 3 a
6 mm, pudiendo incluir un robinete para el control
exacto del caudal. Generalmente se emplea una
varilla de vidrio u otro material para colocar un
trozo de lana de vidrio o algodón, en la base del
tubo, y si fuera necesario, compactar el adsorbente
o una suspensión del mismo uniformemente dentro
del tubo. En algunos casos, en la base del tubo se
encuentra soldado un disco de vidrio poroso que
actúa como soporte del contenido del tubo. Colocar
el adsorbente especificado en la monografía
correspondiente de manera que se forme una
columna compacta, homogénea y sin fisuras.
Los adsorbentes más empleados son alúmina,
gel de sílice activado y tierra de diatomeas.
Procedimiento
- Disolver la muestra en una
cantidad apropiada de solvente y agregarla por el
extremo superior de la columna. Dejar que esta
solución se adsorba y luego agregar nuevas
porciones de solvente, de manera que fluya a través
de la columna espontáneamente, por aplicación de
vacío en la base o ejerciendo presión en el extremo
superior. En algunos casos, puede modificarse el
procedimiento de carga de la muestra en la
columna. Si el producto es sólido (como por ej.,
comprimidos pulverizados) se lo mezcla
íntimamente con una porción del adsorbente
empleado para rellenar la columna, sin necesidad de
separarlo de su excipiente y se agrega esta mezcla
al extremo superior de la columna. El paso
posterior de solvente hace progresar la sustancia a
través de la columna.
La separación y aislamiento puede mejorarse
haciendo circular mayores cantidades de fase móvil
o un solvente de mayor poder eluyente, a través de
la columna y recolectando distintas fracciones del
eluato que contienen los componentes de la
muestra.
La eficiencia de la separación suele controlarse
realizando un cromatograma en capa delgada de las
fracciones individuales.
Cromatografía de partición
Preparación de la columna
- Emplear un tubo
cromatográfico de aproximadamente 22 mm de
diámetro interno y 200 a 300 mm de largo, sin disco
de vidrio poroso en su extremo, al que se ajusta un
tubo de salida, sin robinete, de aproximadamente
4 mm de diámetro interno y 50 mm de largo, a
menos que se especifique de otro modo en la
monografía correspondiente. Adaptar un trozo de
lana de vidrio en la base del tubo. Transferir el
volumen de fase estacionaria y la cantidad de
soporte sólido especificados en la monografía
correspondiente a un vaso de precipitados de 100 a
250 ml y mezclar hasta obtener una mezcla
homogénea y espesa. Transferir esta mezcla al tubo
cromatográfico y apisonar presionando suavemente,
hasta obtener una masa uniforme. Si la cantidad de
soporte sólido especificada es mayor de 3 g,
transferir la mezcla al tubo en porciones de
aproximadamente 2 g y apisonar cada porción.
Procedimiento
- La muestra se puede agregar a
la parte superior de la columna disuelta en un
volumen apropiado de fase móvil o empleando una
solución de la muestra en un volumen apropiado de
fase estacionaria mezclada con una parte adicional
del soporte sólido y transferida a la parte superior
de la columna como una capa extra de soporte. La
muestra puede también ser incorporada en la fase
estacionaria,
completando
la
transferencia
cuantitativa al tubo cromatográfico, lavando el vaso
de precipitados, empleado para la preparación de la
muestra,
y
agregando
una
mezcla
de
aproximadamente 1 g de soporte sólido y varias
gotas del solvente empleado para preparar la
solución muestra. Colocar un trozo de lana de
vidrio fina por encima del soporte de la fase
estacionaria para completar la columna. Dejar que
se adsorba completamente en la fase estacionaria y
luego agregar fase móvil en varias porciones,
permitiendo que cada una penetre en la columna
completamente, antes de comenzar la elusión.