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100. CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es un método por el cual las
sustancias se separan mediante un proceso de
migración diferencial en un sistema que consta de
dos fases. Una fase que fluye continuamente en una
dirección dada (fase móvil) y otra que permanece
fija (fase estacionaria). En estos sistemas los
componentes de una mezcla pueden presentar
diferentes movilidades debido a diferencias en la
capacidad de adsorción, partición, solubilidad,
presión de vapor, tamaño molecular o carga. Los
mecanismos de separación son: adsorción,
disolución y partición, filtración y permeación o
tamices moleculares, intercambio iónico.
Las técnicas aplicadas mediante los distintos
mecanismos-mencionados empleados en esta
Farmacopea son: Cromatografía en columna,
Cromatografía en papel, Cromatografía en capa
delgada, Cromatografía de gases, Cromatografía
líquida de alta eficacia y Cromatografía de
exclusión.
La
Cromatografía de adsorción
se basa en la
separación de un soluto entre la fase estacionaria
constituida por un adsorbente, como por ej.,
alúmina activada, sílica gel y resinas de intercambio
iónico y la fase móvil constituida por el solvente de
elusión.
La
Cromatografía de partición
se basa en la
distribución selectiva del soluto entre la fase
estacionaria y la fase móvil. Se clasifica en
cromatografía de partición en fase normal y
cromatografía de partición en fase reversa. En la
cromatografía de partición en fase normal las
sustancias a separar se distribuyen entre dos
líquidos inmiscibles uno de los cuales es más polar,
actúa como fase estacionaria y se encuentra
adsorbido sobre un soporte sólido, brindando una
gran superficie de contacto a la fase móvil menos
polar. En la cromatografía de partición en fase
reversa la fase estacionaria es menos polar que la
fase móvil.
El grado de partición de un compuesto dado
entre las dos fases líquidas se expresa por su
coeficiente de partición o de distribución y puede
modificarse variando la composición de la fase
móvil. En el caso de compuestos que se disocian, la
distribución se puede controlar modificando, entre
otras propiedades, el pH, la constante dieléctrica y
la fuerza iónica.
La
Cromatografía de intercambio iónico
se
emplea para separar compuestos ionizables y
solubles en agua. Las fases estacionarias empleadas
son generalmente resinas orgánicas sintéticas. Las
resinas de intercambio catiónico contienen sitios
activos con carga negativa y se emplean para
separar compuestos básicos, como por ej., las
aminas. Las resinas de intercambio aniónico tienen
sitios activos con carga positiva para la separación
de compuestos ácidos, como por ej., fosfatos,
sulfonatos o carboxilatos. Los compuestos iónicos
o ionizables, solubles en agua, son atraídos a las
resinas y las diferencias en la afinidad producen la
separación cromatográfica. El pH de la fase móvil,
la temperatura, el tipo de ion, la concentración
iónica y los modificadores orgánicos afectan el
equilibrio; estas variables pueden ajustarse para
obtener el grado de separación deseado.
La
Cromatografía por tamices moleculares
se
basa en el intercambio repetido de los compuestos
con la fase móvil y con la fase líquida estacionaria
que se encuentra dentro de los poros del material de
relleno.
Empleo de Sustancias de referencia en ensayos
de identificación
- En Cromatografía en papel y en
Cromatografía en capa delgada, la relación entre la
distancia recorrida por una sustancia y la distancia
recorrida por el frente de la fase móvil, se denomina
relación de frente,
R
f
, de la sustancia. La relación
entre la distancia recorrida por una sustancia y la
distancia recorrida por una
Sustancia de referencia
,
se denomina
R
E
de la sustancia.
En el caso de la Cromatografía en papel se han
observado diferencias en el valor de
R
f
Los valores absolutos de
R
cuando los
cromatogramas se desarrollan en dirección paralela
a las fibras de papel en comparación con los
desarrollados en forma perpendicular a dicha
dirección. En consecuencia, la orientación de las
fibras del papel en lo que se refiere al flujo de la
fase móvil debe ser la misma para una serie de
cromatogramas.
[NOTA: por lo general, el
fabricante indica el sentido de las fibras en los
envases de papel para Cromatografía].
f
, son difíciles de
establecer, ya que varían con las condiciones
experimentales por lo tanto se logra una mejor
identificación cuando se emplea una muestra de la
sustancia a ensayar como
Sustancia de referencia
.
Para este fin se preparan soluciones de la muestra,
la
Sustancia de referencia
y una mezcla de partes
iguales de ambas y se aplican sobre una línea
paralela a uno de los bordes de la placa
cromatográfica u hoja de papel. Cada aplicación
contiene aproximadamente la misma cantidad, en
peso, de la muestra y la
Sustancia de referencia.
Si
la misma y la
Sustancia de referencia
son idénticas,
todos
los
cromatogramas
deben