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345. ENSAYO DE
SALMONELLA
/FRACCIÓN MICROSOMAL
(TEST DE AMES) PARA DETECCIÓN DE MUTAGENICIDAD
El ensayo de Salmonella-fracción microsomal (o
test de Ames) es una prueba
in vitro
que permite
evaluar el potencial efecto mutagénico de
compuestos químicos o productos biológicos como
una medida indirecta del posible efecto
carcinogénico sobre seres humanos. Esta prueba
utiliza varias cepas de
Salmonella thyphimurium
auxótrofas para el aminoácido histidina, que poseen
distintas mutaciones en genes del operón histidina.
Esas mutaciones son el blanco para mutágenos que
producen daño al ADN por diferentes mecanismos.
Cuando esas cepas de
Salmonella
se siembran sobre
placas de medio mínimo-glucosa (placas MG) que
contienen trazas de histidina, sólo pueden crecer en
él las bacterias que revirtieron al fenotipo
his+
. El
número de colonias revertantes por placa
producidas en forma espontánea es relativamente
constante para cada cepa. Por eso cuando se agrega
un mutágeno a la placa, el número de colonias
revertantes aumenta de manera dependiente de la
dosis de dicho mutágeno.
Como las bacterias son incapaces de
metabolizar
productos
químicos
mediante
citocromos P450, como los mamíferos y otros
vertebrados, un componente clave del ensayo para
hacerlo realmente útil es el agregado de un
Sistema
exógeno de activación metabólica de mamífero
; se
emplea habitualmente fracción microsomal de
hígado de rata.
Cepas
Se utilizan las cepas de
Salmonella typhimurium
TA 97a, TA 98, TA 100, TA 102, TA 1535 y TA
1538. Las mismas deberán ser provistas por un
centro de referencia que certifique su autenticidad.
Éstas se conservarán congeladas a -80 ºC (en
freezer) o en nitrógeno líquido. Su mantenimiento
se realizará de acuerdo a lo aconsejado por el
proveedor o lo acostumbrado por el laboratorio.
Los cultivos congelados se prepararán a partir de
cultivos frescos a los que se les agregará un agente
crioprotector (por ejemplo Glicerol al 10 % v/v
concentración final).
Cada cepa tiene una mutación en el operón
histidina y otras mutaciones que aumentan su
capacidad para detectar mutágenos. Los genotipos
relevantes de las cepas se detallan en la
Tabla 1
.
Tabla 1
Cepa
Mutación operón
histidina
Reversión
bio
uvrB
LPS
Plásmido
TA 97a
hisD6610
Corrimiento de
armazón
Deleción
rfa
pKM101
TA 98
hisD3052
Corrimiento de
armazón
Deleción
rfa
pKM101
TA 100
his G46
Sustitución
Deleción
rfa
pKM101
TA 102
hisG428
Transición
/transversión Tipo salvaje
rfa
pKM101, pAQ1
TA 1535
his G46
Sustitución
Deleción
rfa
-
TA 1538
hisD3052
Corrimiento de
armazón
Deleción
rfa
-
bio
uvrB
: la mutación por deleción de
uvrB
elimina el sistema de reparación de ADN por
escisión. Eso aumenta la mutabilidad de la bacteria
y la hace sensible a la irradiación con luz UV. La
deleción abarca también el gen para biotina lo que
hace que la bacteria sea dependiente de biotina.
rfa
: esta mutación produce una síntesis
defectuosa del lipopolisacárido (LPS) de pared lo
que aumenta la permeabilidad de la bacteria para
compuestos voluminosos. La bacteria se vuelve
sensible al colorante Cristal Violeta.
Plásmido pKM101: aumenta la mutagénesis
química e inducida por UV mediante un aumento de
la ruta de reparación por recombinación, propensa a
error. El plásmido confiere resistencia a ampicilina.
Plásmido pAQ1: este plásmido multicopia lleva
la mutación
hisG428
. Eso amplifica el número de
sitios para la acción del mutágeno con el
consiguiente aumento de reversión de la cepa
portadora. El plásmido confiere resistencia a
tetraciclina.