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Analizar cada envase de medio de cultivo de
manera de verificar la aptitud del mismo para su
uso. Si el medio se prepara a partir de los ingredien-
tes analizar todos los lotes elaborados. Si se trata de
medios listos para usar, asegurar la calidad de los
mismos.
Para medios sólidos, el crecimiento obtenido
con los microorganismos de prueba (ver
Tabla 3
)
no debe diferir en un factor de 2 respecto del obte-
nido con un envase previamente aprobado.
Los medios líquidos deben presentar evidencia
visual de crecimiento dentro de los 3 días de incu-
bación a 30 – 35 °C para bacterias y 5 días de incu-
bación a 20 – 25 °C para hongos y levaduras.
El número de microorganismos a inocular debe
ser próximo a 100 ufc.
Validez del método de recuento
Diluir la muestra en un diluyente apropiado de
acuerdo a la técnica a ensayar. Agregar separada-
mente diluciones de cultivos de 24 horas de
Staphy-
lococcus aureus (
ATCC 6538),
Pseudomonas aeru-
ginosa (
ATCC 9027) y
Candida albicans (
ATCC
10231). ncluir
Escherichia coli
(ATCC 8739) en
aquellos productos que en la
Tabla 1
no requieren
ausencia de la misma y suspensiones de esporas de
Aspergillus brasiliensis (
ATCC 16404) y
Bacillus
subtilis (
ATCC 6633).
Pueden utilizarse cepas aptas para tales fines
pertenecientes a colecciones de cultivo microbianas
reconocidas por la WFCC (World Federation of
Culture Collections). El número de microorganis-
mos a inocular debe ser tal que en cada placa de
Petri el recuento final sea próximo a 100 ufc.
Siguiendo el método de estudio, realizar el re-
cuento en presencia y ausencia de la muestra a
ensayar. Incluir controles negativos de medios y
diluyentes.
El recuento de los microorganismos ensayados
con la muestra no debe diferir en un factor mayor
de 2 respecto del hallado sin la muestra.
Cuando no se obtiene el criterio de aceptación
establecido, modificar el método de ensayo de
acuerdo a:
- aumentar el factor de dilución siempre que la
especificación del producto o materia prima lo
permita;
- agregar un antagonista adecuado (ver
Tabla 2
);
- otra modificación apropiada del método, dilu-
yente o medio de cultivo;
- una combinación de los anteriores.
En caso de agregar una sustancia antagonista, o
si se cambia la composición del diluyente o medio
de cultivo, demostrar que dicha modificación no
tiene efecto tóxico que afecte el desarrollo de los
microorganismos de prueba.
Para demostrar la validez del método de recuen-
to por filtración, la suspensión con los microorga-
nismos se agrega en el último lavado, para evaluar
la ausencia de sustancias inhibitorias en la membra-
na que puedan afectar su crecimiento.
En el recuento en placa, las suspensiones de las
cepas de control se agregan en la dilución del pro-
ducto. En caso de no cumplir el criterio de acepta-
ción habiendo efectuado todas las modificaciones
detalladas anteriormente, los microorganismos
podrán inocularse directamente en la placa antes del
agregado del medio sólido, para evaluar la remo-
ción del agente inhibitorio.
Si no se encuentra un método de neutralización
adecuado, puede suponerse que la imposibilidad de
aislar el microorganismo inoculado es atribuible a
la actividad microbicida del producto. Esta infor-
mación permite deducir que no es probable que el
producto se contamine con esa determinada especie
de microorganismo.
Es posible que el producto inhiba solamente al-
gunos microorganismos especificados en este capí-
tulo pero que no inhiba otros no incluidos entre las
cepas de prueba o aquellos para los cuales éstas no
son representativas. En consecuencia, realizar la
prueba con el factor de dilución más alto compati-
ble con el crecimiento y el criterio de aceptación
específico.
Recuento de microorganismos aerobios tota-
les
Cuando sea posible su aplicación, el método de
elección es el de Recuento en placa. En caso contra-
rio se podrán utilizar los métodos por filtración o en
tubos múltiples (número más probable - NMP).
Preparación de la muestra -
Disolver o sus-
pender 10 g o 10 ml de muestra en el diluyente
definido en la
Validez del método de recuento
, para
obtener una dilución 1:10 o la resultante de la Vali-
dez. Las diluciones así preparadas no deben dejarse
más de 1 hora antes de completar el ensayo.
Siembra en profundidad -
Transferir 1 ml de la dilución final a cada una de
dos placas de Petri estériles. Agregar inmediata-
mente a cada placa entre 15 y 20 ml del Agar Dige-
rido de Caseína-Soja previamente fundido y enfria-
do a 45 °C. Tapar las placas de Petri, homogeneizar
la muestra con el agar por rotación de las placas y
dejar solidificar a temperatura ambiente. Invertir las
placas de Petri e incubar a 30 - 35 °C durante no
menos de 3 días
.
Luego de la incubación, examinar
las placas para observar si hubo desarrollo. Contar
el número de colonias y expresar el promedio para
las dos placas en términos del número de unidades
formadoras de colonias por g (ufc/g) o por ml de