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[NOTA: es importante demostrar por la valida-
ción, la adecuabilidad del kit usado, chequeando el
tiempo de generación de factor X para determinar el
tiempo necesario para alcanzar el 50 % de la gene-
ración máxima de factor X.]
Reactivo factor de coagulación
- Contiene pro-
teínas purificadas de origen humano o bovino.
Estas incluyen el factor X, factor IXa, y un activa-
dor del factor VIII usualmente trombina. Estas
proteínas parcialmente purificadas, al menos hasta
el 50 %, no contienen impurezas que interfieren con
la activación del factor VIII o del factor X. La
trombina puede estar presente en su forma precur-
sora protrombina, siempre que su activación en el
reactivo sea suficientemente rápida para provocar la
activación completa y prácticamente instantánea del
factor VIII durante el ensayo. Los fosfolípidos se
pueden obtener de un sustrato natural o pueden
prepararse por síntesis, pero deben contener una
proporción importante, de fosfatidilserina. Los
componentes del reactivo completo suelen encon-
trarse separados en al menos dos reactivos distintos,
carentes de la capacidad de formar el factor Xa por
sí solos. Uno de los reactivos contiene iones calcio
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Después de la reconstitución, éstos se pueden com-
binar, siempre que se pruebe que no se generan
cantidades significativas de factor Xa en ausencia
del factor VIII. En la mezcla de incubación final, el
factor VIII debe ser el único componente limitante
de la velocidad.
El segundo paso comprende la cuantificación
del factor Xa formado, empleando un sustrato cro-
mogénico específico para el factor Xa. General-
mente consiste en un péptido corto derivatizado, de
entre 3 y 5 aminoácidos, unido a un grupo cromófo-
ro. Cuando se cliva este grupo a partir del péptido
sustrato, se produce un cambio de absorbancia a
una longitud de onda apropiada que permite su
cuantificación espectrofotométrica. El sustrato
debe contener también inhibidores apropiados para
detener la formación adicional del factor Xa (por
ejemplo agentes quelantes) y suprimir la actividad
de la trombina.
Prediluyente
- Consiste de plasma de un pa-
ciente con hemofilia A grave, o de un reactivo pre-
parado artificialmente que contenga suficiente fac-
tor von Willebrand y que de resultados que no difie-
ren significativamente de los obtenidos empleando
plasma hemofílico en las preparaciones patrón y
problema. Los materiales prediluidos deben ser
estables durante un tiempo superior al requerido
para el ensayo.
Preparación estándar
- Reconstituir el conteni-
do de la ampolla mediante el agregado de una can-
tidad apropiada de agua
;
usar inmediatamente.
Realizar una dilución con suficiente cantidad de
Prediluyente
para obtener una solución que conten-
ga entre 0,5 y 2,0 Unidades Internacionales por
mililitro. Preparar las siguientes diluciones de la
preparación estándar empleando una solución
isotónica regulada, no quelante que contenga 1 %
de albúmina humana o bovina, por ejemplo,
tris(hidroximetil)aminometano o imidazol. Preparar
preferentemente por duplicado y en forma indepen-
diente por lo menos tres diluciones en progresión
geométrica o aritmética. La concentración final del
factor VIII deberá ser inferior a 0,01 UI por ml
durante el paso de formación del factor Xa.
Preparación muestra
- Reconstituir el conteni-
do de la ampolla según se indica en el rótulo y em-
plear inmediatamente. Realizar una dilución con
suficiente cantidad de
Prediluyente
para obtener
una solución que contenga entre 0,5 y 2,0 UI por
mililitro. Preparar las siguientes diluciones emple-
ando una solución isotónica regulada, no quelante
que contenga 1 % de albúmina humana o bovina,
por ejemplo, tris(hidroximetil)aminometano o imi-
dazol. Preparar preferentemente por duplicado y
en forma independiente por lo menos tres dilucio-
nes en progresión geométrica o aritmética. La con-
centración final del factor VIII en la mezcla reac-
ción deberá ser inferior a 0,01 UI por ml durante el
paso de formación del factor Xa.
Procedimiento
- Preparar una solución blanco
que incluya todos los componentes excepto el fac-
tor VIII. [NOTA: preparar todas las diluciones en
tubos de plástico y emplearlas inmediatamente. Se
debe realizar al menos dos replicas de cada dilu-
ción.]
Etapa 1.
Mezclar las diluciones precalentadas
de la
Preparación estándar
y la
Preparación mues-
tra
con un volumen apropiado de
Reactivo factor de
coagulación
, también precalentado, o con la combi-
nación de sus constituyentes separados. Incubar en
tubos de plástico o en pocillos de microplaca a
37 °C. Las concentraciones de los distintos compo-
nentes durante la formación del factor Xa deben ser
las especificadas anteriormente en la descripción de
los reactivos. Permitir que la activación del factor
X proceda durante un tiempo apropiado, terminan-
do la reacción (Etapa 2) cuando la concentración
del factor Xa alcance aproximadamente el 50 % del
nivel máximo. Los tiempos de activación están
normalmente entre 2 y 5 min.
Etapa 2.
Determinar el factor Xa por agregado
del sustrato cromogénico precalentado. Cuantificar
la proporción de sustrato escindido, que debe ser
lineal con respecto a la concentración del factor Xa
formado, midiendo en un espectrofotómetro el
cambio de absorbancia a una longitud de onda
apropiada. Puede registrarse la absorbancia de