Versión de HTML Básico
2
0,2
1,1
3
0,3
1,0
4
0,4
0,9
5
0,5
0,8
6
0,6
0,7
7
0,7
0,6
8
0,8
0,5
9
0,9
0,4
10
1,0
0,3
11
1,1
0,2
12
1,2
0,1
Tres tubos Control de
células con 0 % de
hemólisis
-
1,3
Tres tubos al 100 % de
hemólisis
-
1,3 ml de agua
Agregar 0,2 ml de
Eritrocitos de carnero sensi-
bilizados
a cada tubo, mezclar e incubar a 37 °C
durante 60 minutos. Enfriar los tubos en un baño de
hielo y centrifugar a 1.000
g
durante 5 minutos.
Medir la absorbancia del sobrenadante a 541 nm y
calcular el grado de hemólisis (
Y
) por la fórmula
siguiente:
(
A
c
–
A
1
) / (
A
b
–
A
1
)
en la cual
A
c
es la absorbancia de los
Tubos 1
a
12
,
A
b
es la absorbancia media de los tres tubos con
hemólisis al 100 % y
A
1
es la absorbancia media de
los tres tubos sin hemólisis.
Representar una curva sobre papel doble lo-
garítmico con los valores de
Y
/(1-
Y
) en función al
volumen de complemento diluido en mililitros.
Hallar la ecuación de la recta que mejor ajuste al
conjunto de puntos y determinar el valor en ordena-
das que corresponda al 50 % de dosis hemolítica del
complemento donde
Y
/(1-
Y
) = 1,0. Calcular la acti-
vidad en unidades hemolíticas (CH
50
/ml) de acuer-
do con la fórmula siguiente:
C
d
/5C
a
en la cual
C
d
es el valor inverso de la dilución del
complemento,
C
a
es el volumen en mililitros del
complemento diluido que produce un 50 % de
hemólisis y 5 el factor de escala para tener en cuen-
ta el número de eritrocitos.
El ensayo no será válido a menos que el gráfico
sea lineal entre el 15 % y el 85 % de hemólisis y
que el valor de la pendiente esté comprendido entre
0,15 y 0,40 (preferentemente entre 0,18 y 0,30).
Ensayo de la actividad anticomplemento
Preparar una dilución del
Complemento de co-
bayo
ya titulado con
Solución reguladora gelatina-
barbital
para obtener 100 CH
50
/ml. Agregar la
inmunoglobulina a examinar, ajustada a pH 7 si
fuera necesario. Preparar las mezclas siguientes de
incubación para una inmunoglobulina que contenga
50 mg por ml:
Inmunoglobulina a ser
examinada (ml)
Control de complemento
(por duplicado) (ml)
Inmunoglobulina (50 mg por ml)
0,2
—
Solución reguladora gelatina barbital
0,6
0,8
Complemento
0,2
0,2
Realizar en paralelo los ensayos sobre la in-
munoglobulina a examinar y sobre controles nega-
tivos y positivos de AAC, preparados con inmu-
noglobulina humana según las indicaciones del
prospecto que acompaña a la preparación de refe-
rencia. Si la sustancia a examinar contiene más o
menos de 50 mg por ml de inmunoglobulina,
ajustar adecuadamente los volúmenes de la prepa-
ración y de la
Solución reguladora gelatina-
barbital
, por ejemplo, utilizar 0,33 ml de una
preparación que contenga 30 mg por ml de inmu-
noglobulina y 0,47 ml de
Solución reguladora
gelatina-barbital
para conseguir un volumen total
de 0,8 ml. Tapar los tubos e incubar a 37 °C du-
rante 60 minutos. Agregar 0,2 ml de cada mezcla
de incubación a 9,8 ml de
Solución reguladora
gelatina-barbital
para diluir el complemento.
Para determinar la actividad del complemento
residual, realizar la
Titulación del complemento
en
cada tubo según se ha descrito anteriormente.