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cia de referencia calibrada en Unidades Internacio-
nales por un método cromogénico.
La Unidad Internacional es la actividad de fac-
tor X de una cantidad establecida de patrón Interna-
cional que consiste en un concentrado liofilizado de
factor X humano. La equivalencia en Unidades
Internacionales del Patrón Internacional la establece
la Organización Mundial de la Salud. El método
cromogénico de valoración consiste en dos pasos: la
activación del factor X a factor Xa que depende de
veneno de serpiente y el clivaje enzimático de un
sustrato cromogénico específico para factor Xa,
para dar un cromóforo que puede ser cuantificado
espectrofotométricamente. En las condiciones
apropiadas, existe una relación lineal entre la acti-
vidad del factor Xa y el clivaje del sustrato cro-
mogénico.
Reactivos
Solución reguladora para diluciones
- Solución
de 3,7 g por litro de tris(hidroximetil)aminometano,
18,0 g por litro de cloruro de sodio, 2,1 g por litro
de imidazol, 0,02 g por litro de bromuro de hexa-
dimetrina y 1 g por litro de albúmina bovina o
albúmina humana. Ajustar a pH 8,4, si fuera nece-
sario, con ácido clorhídrico.
Veneno de víbora Russell específico para acti-
var factor X
- Se trata de una proteína derivada del
veneno de víbora Russell’s (
Vipera russelli
) que
activa específicamente el factor X. Reconstituir y
almacenar según se indica en el rótulo.
Sustrato cromogénico para factor Xa
- Sustra-
tos cromogénicos específicos para factor Xa tales
como:
N-
α
-benziloxicarbonil-
D
-arginil-
L
-glicil-
L-
arginina-4-nitroanilida diclorhidrato,
N
-benzoil-
L
-isoleucil-
L
-glutamil-glicil-
L
-arginin-
4-nitroanilida clorhidrato, metanosulfonil-
D
-leucil-
glicil-L-arginin-4-nitroanilida,
metoxicarbonil-
D-
ciclohexilalanil-glicil-
L
-arginin-4-nitroanilida
acetato. Reconstituir según se indica en el rótulo.
Preparación estándar
- Diluir con
Solución re-
guladora para diluciones
para obtener una solución
de 0,18 UI de factor X por mililitro. Preparar, pre-
ferentemente por duplicado y en forma indepen-
diente, al menos tres diluciones en progresión ge-
ométrica o aritmética empleando el mismo solvente.
Preparación muestra
- Diluir con
Solución re-
guladora para diluciones
para obtener una solución
de 0,18 UI de factor X por mililitro. Preparar, pre-
ferentemente por duplicado y en forma indepen-
diente, al menos tres diluciones en progresión ge-
ométrica o aritmética empleando el mismo solvente.
Procedimiento
- Precalentar todas las solucio-
nes en un baño de agua a 37 °C inmediatamente
antes de realizar el ensayo. Las siguientes condi-
ciones de ensayo se utilizan para placas de
96 pocillos. Si el ensayo se lleva a cabo en tubos,
se deben ajustar los volúmenes de manera que se
mantengan las proporciones de la mezcla. Se deben
realizar dos reacciones de cada dilución. En una
placa de 96 pocillos mantenida a 37 °C, agregar por
duplicado 12,5 µl de cada dilución de la
Prepara-
ción muestra
o la
Preparación estándar
a cada uno
de los pocillos. Mezclar volúmenes iguales de
Veneno de víbora Russell específico para activar
factor X
y cloruro de calcio 0,1M, transferir 25 µl a
cada pocillo e incubar durante exactamente
90 segundos. A cada pocillo agregar 150 µl de
Sustrato cromogénico para factor Xa
diluido 1 en 6
con
Solución reguladora para diluciones
.
[
NOTA:
se admiten modificaciones de volúmenes de la
reacción si con ellas se obtiene una mejor lineali-
dad
]
. Determinar la velocidad de cambio de absor-
bancia (ver
470
.
Espectrofotometría ultravioleta y
visible
) a 405 nm de forma continua durante
3 minutos y obtener el promedio de velocidad de
cambio de absorbancia (
∆
A/min). Si no se puede
medir en forma continua, leer la absorbancia a
405 nm a intervalos consecutivos adecuados, duran-
te 40 segundos, o también es posible detener la
reacción de hidrólisis tras un intervalo apropiado
bajando el pH por adición de un reactivo conve-
niente, como ácido acético al 50 % v/v o una solu-
ción de citrato 1 M. Ajustar el tiempo de hidrólisis
para conseguir un incremento lineal del cromóforo
a lo largo del tiempo. Con los valores
∆
A/min o A
de cada dilución tanto de muestra como el estándar.
Comprobar la validez del ensayo y calcular la po-
tencia de la preparación a examinar empleando los
métodos estadísticos habituales (ver
10. Análisis
estadístico de resultados de ensayos biológicos
).
VALORACIÓN DEL FACTOR DE VON
WILLEBRAND
La potencia del factor de von Willebrand huma-
no se determina comparando su actividad en la
unión a colágeno o como cofactor ristocetina con la
misma actividad de una preparación de referencia
calibrada en Unidades Internacionales contra el
estándar internacional.
La Unidad Internacional se define como la acti-
vidad de una cantidad establecida de Patrón Inter-
nacional para factor de von Willebrand en concen-
trado de factor VIII de coagulación humana. La
equivalencia en Unidades Internacionales del
Patrón Internacional la establece la Organización
Mundial de la Salud.
Ensayo de unión a colágeno
La unión a colágeno se determina por un Enzi-
moinmunoensayo sobre placas cubiertas con colá-
geno. El método se basa en la unión específica del