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diámetro. El caudal debe ser aproximadamente
1,0 ml por minuto.
Hexano deshidratado
- Preparar una columna
cromatográfica empacando un tubo cromatográfico
de 60 cm × 8 cm, con 500 g de tierra silícea para
cromatografía, con un tamaño de partícula de 50 a
250 µm, activada por secado a 150 °C durante
4 horas (ver
Cromatografía de adsorción en
columna
en
100. Cromatografía
). Pasar 500 ml de
hexano a través de la columna y recolectar el eluido
en un recipiente con tapa de vidrio.
Fase móvil
- Alcohol
n
-amílico en
Hexano
Deshidratado
(3 en 1.000). Hacer los ajustes
necesarios (ver
Aptitud del sistema
en
100.
Cromatografía
).
Solución de aptitud del sistema
- Disolver
aproximadamente 250 mg de Vitamina D para
Aptitud del Sistema de Valoración SR-FA en 10 ml
de una mezcla de tolueno y
Fase móvil
(50:50).
Calentar esta solución a reflujo a 90 °C durante
45 minutos y enfriar. Esta solución contiene
colecalciferol,
pre-colecalciferol
y
trans
-colecalciferol.
Preparación estándar
- [NOTA: emplear
material de vidrio inactínico y preparar las
soluciones en el día de su uso]. Pesar exactamente
alrededor de 30 mg de Ergocalciferol SR-FA,
transferir a un matraz aforado de 50 ml, disolver en
tolueno sin calentar, completar a volumen con
tolueno y mezclar. Transferir 10 ml de esta
solución a un matraz aforado de 50 ml, completar a
volumen con
Fase móvil
y mezclar para obtener una
solución de aproximadamente 120 µg por ml.
Preparación muestra
- [NOTA: emplear
material de vidrio inactínico y preparar las
soluciones en el día de su uso]. Pesar exactamente
alrededor de 30 mg de Ergocalciferol, transferir a
un matraz aforado de 50 ml y proceder según se
indica para
Preparación estándar
, comenzando
donde dice: “
disolver en tolueno sin calentar...
”,
para obtener una solución de aproximadamente
120 µg por ml.
Aptitud del sistema
(ver
100. Cromatografía
) -
Cromatografiar la
Solución de aptitud del sistema
y
registrar las respuestas de los picos según se indica
en
Procedimiento
: la resolución
R
entre los picos de
trans
-colecalciferol y pre-colecalciferol no debe ser
menor de 1; los tiempos de retención relativos
deben
ser
aproximadamente
0,4
para
pre-colecalciferol, 0,5 para
trans
-colecalciferol y
1,0 para colecalciferol; la desviación estándar
relativa para inyecciones repetidas no debe ser
mayor de 2 %.
Procedimiento
- Inyectar por separado en el
cromatógrafo volúmenes iguales (entre 5 y 10 µl)
de la
Preparación estándar
y la
Preparación
muestra
, registrar los cromatogramas y medir las
respuestas de los picos principales. Calcular la
cantidad de C
28
H
44
O en la porción de Ergocalciferol
en ensayo.