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470. ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA Y VISIBLE
La espectrofotometría en el ultravioleta y visible
consiste en la medida de la absorción de las
radiaciones electromagnéticas comprendidas en un
intervalo espectral de 200 a 400 nm para la región
ultravioleta y de 400 a 700 nm para la región
visible.
El grado en que la radiación es absorbida al
pasar a través de un medio homogéneo se expresa
en términos de absorbancia,
A
. La absorbancia de
una solución es el logaritmo decimal de la inversa
de la transmitancia,
T
, siendo esta última definida:
como la fracción de radicación incidente que logra
atravesar la muestra.
Para una radiación
monocromática,
A
se calcula mediante la siguiente
expresión:
I I
T
A
/
log
/1 log
0
donde
I
o
kdc A
es la intensidad de radiación incidente e
I
es la intensidad de radiación transmitida.
De acuerdo con la ley de Lambert-Beer, la
absorbancia es proporcional al paso óptico,
d
, de la
capa absorbente atravesada por la radiación y a la
concentración,
c
, del analito:
La constante de proporcionalidad,
k
, asume
distintas denominaciones según las unidades en que
d
y
c
son expresadas:
Absortividad
(
a
): es la absorbancia de una
solución cuya concentración,
c
, es de 1 g por litro,
medida en una celda de paso óptico,
d
, de 1 cm.
cdA a
/
Coeficiente de extinción específica
[
E
(1 %,
1 cm)]: es la absorbancia de una solución cuya
concentración, c, es de 1 %, medida en una celda de
paso óptico,
d
, de 1 cm,
a
cdA cm E
10
/
1%, 1
Absortividad molar
(
+
): es la absorbancia de
una solución cuya concentración es 1 mol por litro,
medida en una celda de paso óptico,
d
, de 1 cm.
Puede calcularse como el producto de la
absortividad por el peso molecular,
PM
, del analito.
+
=
aPM
Los valores de
a
,
E
(1 %, 1 cm) y
+
, a una
longitud de onda específica y en un solvente
determinado son característicos del analito.
Aparato
- Consta de un sistema óptico capaz
de producir luz monocromática en la región de 200
a 800 nm, un dispositivo para seleccionar una banda
angosta de longitudes de onda, una celda para
contener la muestra y un detector apropiado para
determinar la absorbancia.
Cuando se emplean aparatos de doble haz, la
celda que contiene el blanco se coloca en el haz de
referencia. Las celdas empleadas para la solución
muestra y el blanco deben tener las mismas
características espectrales.
Calibración del aparato
- Los aparatos
empleados para registrar los espectros ultravioleta y
visible indicados en esta Farmacopea deben cumplir
con los siguientes ensayos:
Verificación de la escala de longitud de onda
-
La escala de longitud de onda puede verificarse
midiendo los máximos de absorbancia de una
solución estándar de perclorato de holmio a 241,15;
287,15; 361,50 y 536,30 nm, los máximos de
absorbancia correspondientes a las líneas de
emisión de una lámpara de hidrógeno a 486,10 nm
o deuterio a 486,00 nm, o las líneas de un arco de
vapor de mercurio a 253,70; 302,25; 313,16;
334,15; 365,48; 404,66; 435,83; 546,07; 576,96 y
579,07 nm. La tolerancia permitida es de ± 1 nm
para el ultravioleta y ± 3 nm para el visible.
Control de absorbancias
-
Controlar la
absorbancia con una solución de dicromato de
potasio preparada según se indica a continuación:
Solución de dicromato de potasio
- Transferir a
un matraz aforado de 1 litro aproximadamente
60 mg de dicromato de potasio, exactamente
pesados y previamente secados a 130 ºC hasta peso
constante. Disolver y diluir a volumen con ácido
sulfúrico 0,005 M.
Registrar el espectro de la
Solución de
dicromato de potasio
y determinar las absorbancias
a las longitudes de onda especificadas en la
Tabla
.
Los valores de
E
(1 %, 1 cm) deben estar dentro de
las tolerancia especificadas.
Tabla.
Longitud de onda (nm)
E
(1 %, 1 cm)
Tolerancia máxima
235
124,5
122,9 a 126,2
257
144,0
142,4 a 145,7
313
48,6
47,0 a 50,3