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Para electroforesis en gel
. El dispositivo consta
esencialmente de una placa de vidrio (por ej., un
portaobjetos de microscopio) sobre la que se
deposita, en la totalidad de su superficie, una capa
firmemente adherida de gel de espesor uniforme.
La conexión entre el gel y la solución conductora se
realiza de varios modos, dependiendo del tipo de
aparato empleado. Se deben tomar precauciones
para evitar la condensación de humedad o el
desecado de la capa sólida.
-
Dispositivo de medida o medio de detección
.
Procedimiento
- Transferir la solución del
electrolito a los compartimentos electródicos.
Colocar el soporte apropiadamente impregnado con
el electrolito en la cubeta según las condiciones
indicadas para el tipo de aparato empleado.
Localizar la zona de aplicación y aplicar la muestra.
Aplicar la corriente eléctrica durante el tiempo
especificado. Luego de desconectar la corriente,
retirar el soporte de la cubeta electroforética, secar
y revelar.
ELECTROFORESIS SOBRE GEL
CILÍNDRICO DE POLIACRILAMIDA
En la electroforesis sobre gel cilíndrico de
poliacrilamida, la fase estacionaria está constituida
por un gel preparado con una mezcla de acrilamida
y N, N’-metilenobisacrilamida; los geles se
preparan en tubos, generalmente de 0,5 cm de
diámetro interno y 7,5 cm de longitud; en cada tubo
se aplica una sola muestra.
Aparato
- Consta de dos compartimentos
destinados a las soluciones reguladoras, fabricados
con un material apropiado como polimetacrilato de
metilo, dispuestos en posición vertical uno arriba
del otro. Cada compartimento está provisto de un
electrodo de platino que se conecta con un
generador de corriente continua que permite
trabajar a intensidad constante o voltaje constante.
Para los geles cilíndricos, el compartimento
superior está provisto en su base de varios
dispositivos para los tubos situados equidistantes al
electrodo.
Procedimiento
- [NOTA: se recomienda
desgasificar las soluciones antes de la
polimerización y emplear el gel inmediatamente
después de su preparación]. Preparar la mezcla de
geles según se especifica en la monografía
correspondiente. Verter la mezcla de gel en tubos
apropiados, tapados en la parte inferior, igualar el
nivel de gel en cada uno de los tubos y rellenar
hasta 1 cm del borde superior. Evitar que queden
burbujas de aire atrapadas en el interior de los
tubos. Cubrir la mezcla de gel con una capa de
agua para evitar el contacto con el aire y dejar
reposar para que ocurra la gelificación. Por lo
general, la formación del gel requiere
aproximadamente 30 minutos y se completa cuando
se produce una interfase nítida entre el gel y la capa
de agua. Eliminar la capa de agua, rellenar el
compartimento inferior con la solución reguladora
indicada en la monografía correspondiente y
destapar los tubos. Introducir los tubos en los
dispositivos del compartimento superior y ajustarlos
de modo que la parte inferior de los tubos se
encuentre inmersa en la solución reguladora del
compartimento inferior.
Rellenar los tubos
cuidadosamente con la solución reguladora
especificada. Preparar la solución muestra y la
solución de referencia con el identificador
especificado y aumentar la densidad de estas
soluciones mediante el agregado de sacarosa.
Aplicar ambas soluciones en la superficie del gel,
empleando un tubo diferente para cada solución.
Agregar la misma solución reguladora en el
compartimento superior. Conectar los electrodos al
generador de corriente y desarrollar la electroforesis
a la temperatura y el voltaje o intensidad de
corriente constantes especificados en la monografía
correspondiente.
ELECTROFORESIS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA CON DODECIL SULFATO
DE SODIO (SDS-PAGE)
La electroforesis en gel de poliacrilamida se
emplea con fines de caracterización cualitativa de
proteínas en preparaciones biológicas, control de
pureza y determinaciones cuantitativas.
La electroforesis analítica en gel es un método
apropiado para identificar y controlar la
homogeneidad de las proteínas en productos
farmacéuticos. También se emplea para estimar los
pesos moleculares de subunidades proteicas y para
determinar las subunidades que componen las
proteínas purificadas.
Características de los geles de poliacrilamida
Las propiedades de tamización de los geles de
poliacrilamida se deben a su particular estructura,
una red tridimensional de fibras y poros obtenida
mediante enlaces cruzados de unidades de
bisacrilamida bifuncionales con cadenas adyacentes
de poliacrilamida. La polimerización se cataliza a
través de un generador de radicales libres
constituido por persulfato de amonio y
tetrametiletilendiamina.
Si se aumenta la concentración de acrilamida del
gel, disminuye su tamaño de poro efectivo. Este se
define, desde el punto de vista operativo, por sus
propiedades de tamización molecular; es decir, la
resistencia con la que se opone a la migración de