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obtener 100 ml. Para muestras que no pudieran ser
pipeteadas a esta dilución inicial de 1:10, diluirlas
hasta obtener una suspensión que pueda ser
pipeteada, como por ej., 1:50 ó 1:100, etc. Realizar
el ensayo de ausencia de propiedades inhibidoras
según se indica en
Ensayos preliminares
antes de la
determinación del
Recuento de aerobios viables
.
Las diluciones así preparadas no deben dejarse más
de 1 hora antes de proseguir con el ensayo.
Procedimiento en placa
- Realizar una dilución,
si fuera necesario, de modo que 1 ml contenga entre
30 y 300 ufc. Transferir 1 ml de la dilución final a
cada una de dos placas de Petri estériles. Agregar
rápidamente a cada placa entre 15 y 20 ml del Agar
Digerido de Caseína-Soja previamente fundido y
enfriado a 45 °C. Tapar las placas de Petri,
homogeneizar la muestra con el agar por rotación
de las placas y dejar solidificar a temperatura
ambiente. Invertir las placas de Petri e incubar
durante 48 a 72 horas. Luego de la incubación,
examinar las placas para ver si hubo desarrollo.
Contar el número de colonias y expresar el
promedio para las dos placas en términos del
número de unidades formadoras de colonias por g
(ufc/g) o por ml de muestra (ufc/ml). Si no se
detectan colonias en las placas que representan la
dilución inicial (1:10) de la muestra, expresar los
resultados como menos de 10 ufc por g o por ml de
muestra.
Procedimiento en tubo
- Agregar a cada uno de
catorce tubos de ensayo de tamaño similar, 9,0 ml
de Caldo Digerido de Caseína-Soja estéril.
Distribuir doce de los tubos en cuatro grupos de tres
tubos cada uno. El grupo de los tres tubos restantes
servirá de control. Transferir 1 ml de la solución o
suspensión de la muestra a cada uno de los tres
tubos de un grupo ("100") y a un cuarto tubo (A) y
mezclar. Transferir 1 ml del contenido del tubo A,
al tubo restante (B) no incluido en ningún grupo y
mezclar. Estos dos tubos contienen 100 mg (ó
100 µl) y 10 mg (ó 10 µl) de la muestra,
respectivamente. Transferir 1 ml del contenido del
tubo a cada uno de los tres tubos del segundo grupo
("10") y 1 ml del contenido del tubo B a cada uno
de los tubos del tercer grupo ("1"). Descartar el
contenido remanente de los tubos A y B. Tapar
bien e incubar todos los tubos. Luego del período
de incubación, examinar los tubos para detectar
desarrollo bacteriano: los tres tubos controles deben
permanecer transparentes y los tubos que contienen
la nuestra deben compararse con la
Tabla 1
.
Ensayo para Staphylococcus aureus y
Pseudomonas aeruginosa
A un volumen de la dilución preparada en
Recuento de aerobios viables, equivalente a 1 g o
1 ml de producto, agregar Caldo Digerido de
Caseína-Soja para obtener 100 ml, mezclar e
incubar.
Examinar el medio para detectar
desarrollo bacteriano y, si lo hubiera, inocular con
un ansa la superficie de Agar Vogel- Johnson (o
Agar Baird-Parker o Agar Manitol-Sal) y de Agar
Cetrimida. Tapar, invertir las placas e incubar. Si
ninguna de las placas contiene colonias con lás
características descriptas en la
Tabla 2
y en la
Tabla
3
para los medios empleados, la muestra cumple
con los requisitos del ensayo para ausencia de
Staphylococcus aureus y de Pseudomonas
aeruginosa por gramo o mililitro.
Ensayo para Staphylococcus aureus
-
Transferir a tubos individuales 0,5 ml de plasma de
mamífero, preferentemente conejo o caballo, con o
sin aditivos apropiados. Con la ayuda de un ansa de
inoculación, transferir a sendos tubos una porción
representativa de cada una de las colonias
sospechosas de la superficie del Agar Vogel-
Johnson (o Agar Baird-Parker o Agar Manitol-Sal),
catalasa positivas. Incubar en un baño de agua a
37°C, durante 3 horas y observar. Posteriormente y
a intervalos apropiados, observar hasta que hayan
transcurrido 24 horas. Efectuar, en paralelo con la
muestra, centro positivos y negativos. La muestra
cumple con los requisitos del ensayo para ausencia
de
Staphylococcus aureus
por gramo o mililitro si
no se observa ningún grado de coagulación. La
presencia dé
Staphylococcus aureus
puede ser
confirmada por otros ensayos bioquímicos
apropiados.
Ensayo para Pseudomonas aeruginosa
- Con la
ayuda de un ansa de inoculación, transferir una
porción representativa de cada una de las colonias
sospechosas de la superficie del Agar Cetrimida a la
superficie de Agar Pseudomonas para la Detección
de Fluorescina y de Agar Pseudomonas para la
Detección de Piocianina. Tapar e invertir los
medios inoculados e incubar a 35 ± 2 °C durante no
menos de 3 días.
Examinar las superficies
inoculadas bajo luz ultravioleta y determinar si las
colonias poseen las características descriptas en la
Tabla 3.
Confirmar la presencia de
Pseudomonas
aeruginosa
en cualquier colonia sospechosa que se
haya desarrollado en uno o más de los medios, por
ensayos bioquímicos apropiados. Transferir las
colonias a tiras o discos de papel de filtro
previamente impregnados con diclorhidrato de N,N-
dimetilp- fenilendiamina: la muestra cumple con los
requisitos del ensayo para ausencia de
Pseudomonas aeruginosa
por gramo o mililitro si
no desarrolla un color rosado, que más tarde se
torna púrpura. La presencia de
Pseudomonas