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como por ej., vidrio, sílica o un polímero orgánico
entrecruzado compatible con la fase móvil.
- Detector. Generalmente los detectores se
basan en propiedades luminiscentes, refractarias o
fotométricas (ver
Detectores
en
Cromatografía de
líquidos de alta eficacia
). [NOTA: si fuera
necesario, se puede conectar a un colector
automático de fracciones].
Procedimiento
- Rellenar la columna según se
especifica en la monografía correspondiente. Las
características de elusión de un compuesto en un
sistema cromatográfico determinado se puede
describir por el coeficiente de distribución,
K
D
( V
, el
cual se calcula por la fórmula siguiente:
I
- V
O
)/( V
T
- V
O
en la cual
V
)
O
es el volumen de retención para la
sustancia no retenida,
V
T
es el volumen de
retención para la sustancia que tiene acceso total a
todos los poros del material de relleno y
V
I
Determinación de la composición relativa de
cada componente en la mezcla
- Proceder para la
separación según se especifica en la monografía
correspondiente. Medir las respuestas de los picos
principales. Si todos los componentes de la muestra
poseen propiedades fisicoquímicas equivalentes,
como por ej., la absortividad, calcular la cantidad
relativa de cada componente dividiendo la respuesta
del pico respectivo por la suma de las respuestas de
los picos de todas las sustancias de ensayo. Si los
componentes de la muestra no poseen propiedades
fisicoquímicas equivalentes calcular el contenido
empleando curvas de calibración obtenidas según se
especifica en la monografía correspondiente.
es el
volumen de retención para la sustancia a ensayar.
Medir cada volumen de retención desde el
momento de la aplicación hasta el momento de cada
pico máximo en particular.
Determinación de pesos moleculares
-
Determinar los pesos moleculares de los
componentes de la muestra comparando con los
estándar de calibración especificados en las
monografías correspondientes.
Graficar los
volúmenes de retención de los estándar de
calibración en función del logaritmo de sus pesos
moleculares. Trazar la línea recta que mejor se
ajuste a los puntos graficados dentro de los límites
de exclusión total y de permeación total. Los pesos
moleculares de los componentes de la muestra se
estiman a partir de la curva de calibración.
Determinación de la distribución de pesos
moleculares en polímeros
- Proceder según se
especifica en las monografías correspondientes.
INTERPRETACIÓN DE LOS
CROMATOGRAMAS
En la
Figura 1
se representa una separación
cromatográfica típica de dos sustancias; 1 y 2,
donde
t
1
y
t
2
son los tiempos de retención,
respectivamente;
h
,
h/2
y
W
h/2
son la altura, la
mitad de la altura y el ancho a la mitad de la altura,
respectivamente, para el pico 1;
W
1
y
W
2
La coincidencia de los tiempos de retención de
una muestra y una
Sustancia de referencia
en un
único sistema cromatográfico puede emplearse
como una característica en la construcción de un
perfil de identidad, pero es insuficiente para
establecer la identidad. Los tiempos de retención
absolutos de un compuesto dado varían de un
cromatograma al próximo.
son los
anchos de los picos 1 y 2 en la línea de base,
respectivamente.
[NOTA: en las siguientes fórmulas, tanto los
volúmenes de retención como las separaciones
lineales son directamente proporcionales al tiempo
de retención y pueden sustituirse en las fórmulas].
Normalmente las comparaciones se hacen en
función de la retención relativa, a, que se calcula
por la fórmula siguiente:
0 1
0 2
t t
t t
en la cual
t
2
y
t
1
son los tiempos de retención de la
muestra y del estándar respectivamente, medidos
desde el punto de inyección, en condiciones
experimentales idénticas en la misma columna y
t
O
El número de platos teóricos
N
, es una medida
de la eficiencia de la columna. Para los picos
gaussianos, se calcula por la fórmula siguiente:
es el tiempo de retención de una sustancia no
retenida, como por ej., metano en el caso de la
cromatografía de gases.
2
16
W
t
N
2
2/1
´
54,5
W
t
N
en la cual
t
es el tiempo de retención de la sustancia,
W
es el ancho del pico en su base, obtenido al
extrapolar los lados del pico con la línea de base y
t’
es la diferencia entre el tiempo de retención de la
sustancia y el tiempo de elusión de una sustancia
que no es retenida (tiempo muerto). El ancho