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contamina accidentalmente con hongos o bacterias
o se rompe, el ensayo no es válido y debe repetirse.
Incluir en el ensayo controles positivos
preparados inoculando no más de 100 ufc de
especies como
M. orale
o
M. pneumoniae.
Al finalizar el periodo de incubación, examinar
microscópicamente todos los medios sólidos
inoculados para la presencia de micoplasmas. El
producto cumple el ensayo si no se produce
crecimiento de micoplasmas en todos los medios
inoculados. Si se produce crecimiento de
micoplasma, el ensayo debe ser repetido una vez
usando el doble de la cantidad de inóculo, medios y
placas, si no se produce crecimiento de
micoplasmas el producto cumple el ensayo. El
ensayo es no válido si no se produce crecimiento en
los controles positivos.
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Los cultivos celulares se tiñen con un colorante
que se une al ADN. Los micoplasmas se detectan
por su patrón particulado o filamentoso de
fluorescencia sobre la superficie de la célula y, en
los casos de contaminación abundante también en
las áreas circundantes.
$ 2
)
Usando un cultivo de células Vero como
sustrato, preensayar el procedimiento usando un
inóculo de no más de 100 ufc de una cepa que
crezca en medio sólido o líquido y desafiar su
capacidad para detectar contaminación potencia por
micoplasmas tales como
Mycoplasma hyorhinis
y
Mycoplasma orale.
Puede utilizarse un sustrato
celular diferente, por ejemplo la línea celular de
producción, si se ha demostrado que provee la
misma sensibilidad para la detectación de potencial
contaminación por micoplasmas.
/
Emplear no más de 1 ml del producto en ensayo
para inocular por duplicado un área no menor a
25 cm
2
del cultivo celular indicador creciendo
confluente. Incluir en el ensayo un control negativo
(no infectado) y dos controles positivos de
micoplasmas tales como
Mycoplasma hyorhinis
y
Mycoplasma orale.
Usar un inóculo de no más de
100 ufc para los controles positivos.
Si para suspensiones virales la interpretación de
los resultados se ve afectada por el efecto
citopático, el virus puede ser neutralizado usando
un antisuero específico que no tenga efecto
inhibitorio sobre micoplasmas o el sustrato celular y
que no permita el crecimiento de los virus. Para
demostrar la ausencia de efectos inhibitorios en el
suero, llevar a cabo controles positivos en presencia
y en ausencia del antisuero.
Procedimiento
Sembrar el cultivo celular a una densidad
regular (2x10
4
a 2x10
5
cel/ml o 4x10
3
a 2,5x10
4
cel/cm
2
) e incubar a 36 ± 1 ºC durante por lo menos
2 días. Inocular el producto en ensayo e incubar
durante por lo menos 2 días; realizar no menos de
un subcultivo. Permitir el crecimiento del último
subcultivo en una superficie apropiada para el
procedimiento del ensayo. No permitir que el
último subcultivo alcance a ser confluente ya que
esto podría inhibir la tinción e impedir la
visualización de los micoplasmas. Descartar el
medio. Enjuagar la monocapa con Solución
reguladora fosfato salina pH 7,4 luego con una
mezcla de iguales volúmenes del mismo solvente y
una solución fijadora apropiada y por último con la
solución fijadora. Agregar la solución fijadora y
dejar reposar durante 10 minutos. Eliminar y
descartar la solución fijadora. Si la monocapa va a
ser teñida posteriormente, secar completamente y si
la monocapa va a ser teñida directamente, eliminar
la solución fijadora con dos lavados con agua
destilada estéril y descartar el agua. Agregar
bisbenzimida diluida (SR) o cualquier otro
colorante para ADN y dejar reposar durante
10 minutos. Eliminar el colorante y lavar la
monocapa con agua.
Examinar por epifluorescencia (filtro de
excitación a 300 nm/380 nm, filtro barrera LP
440 nm) con un aumento entre 100 y 400 o
mayor. Comparar la apariencia microscópica del
cultivo de ensayo con los controles positivos y
negativos,
examinando
la
fluorescencia
extranuclear. Los micoplasmas se visualizan como
puntos o filamentos sobre el citoplasma celular y,
en algunos casos en los espacios intercelulares.
El producto a ser examinado cumple con el
ensayo si no se exhibe evidencia de la presencia de
micoplasmas en los cultivos de ensayo inoculados
con el producto. El ensayo sólo es válido si los
controles positivos exhiben evidencia de la
presencia
de
micoplasma.